论文目录 | |
| 中文摘要 | 第11-13页 |
| Abstract | 第13-16页 |
| 1 前言 | 第16-30页 |
| 1.1 植物中MAPK级联信号通路 | 第16-17页 |
| 1.2 植物中MEKs基因的结构和生物学功能 | 第17-22页 |
| 1.2.1 植物中A组MEKs基因的生物学功能 | 第18-19页 |
| 1.2.2 植物中B组MEKs基因的生物学功能 | 第19-20页 |
| 1.2.3 植物中C组MEKs基因的生物学功能 | 第20-21页 |
| 1.2.4 植物中D组MEKs基因的生物学功能 | 第21-22页 |
| 1.3 植物中MAPK级联信号通路的调控机制 | 第22-28页 |
| 1.3.1 蛋白磷酸酶负调控MAPK级联信号通路 | 第23-25页 |
| 1.3.1.1 MAPK磷酸酶对MAPK级联信号通路的调控 | 第23-24页 |
| 1.3.1.2 植物蛋白磷酸酶PP2Cs对MAPK级联信号通路的调控 | 第24-25页 |
| 1.3.2 microRNA对MAPKs基因转录或转录后水平的调控 | 第25-27页 |
| 1.3.3 支架蛋白对MAPK级联信号通路的调控机制 | 第27-28页 |
| 1.4 本研究的目的与意义 | 第28-30页 |
| 2 材料与方法 | 第30-52页 |
| 2.1 实验材料 | 第30-34页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第30页 |
| 2.1.2 菌株与质粒 | 第30页 |
| 2.1.3 酶及生化试剂 | 第30-31页 |
| 2.1.4 引物 | 第31-33页 |
| 2.1.5 培养基配制 | 第33页 |
| 2.1.6 常用溶液配制 | 第33-34页 |
| 2.2 实验方法 | 第34-52页 |
| 2.2.1 棉花枯萎病菌的培养及孢子悬浮液的制备 | 第34页 |
| 2.2.2 植物的培养条件及处理方法 | 第34页 |
| 2.2.3 棉花总RNA的提取 | 第34-35页 |
| 2.2.4 RNA样品中基因组DNA的去除 | 第35页 |
| 2.2.5 cDNA第一链的合成 | 第35-36页 |
| 2.2.6 PCR产物的回收 | 第36页 |
| 2.2.7 目的片段与克隆载体连接 | 第36-37页 |
| 2.2.8 目的片段与表达载体连接 | 第37页 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第37页 |
| 2.2.10 质粒DNA的提取 | 第37-38页 |
| 2.2.11 重组质粒的酶切鉴定 | 第38页 |
| 2.2.12 农杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第38-39页 |
| 2.2.12.1 农杆菌感受态细胞的制备 | 第38页 |
| 2.2.12.2 农杆菌感受态细胞的转化 | 第38-39页 |
| 2.2.13 农杆菌介导的植物瞬时侵染 | 第39页 |
| 2.2.14 实时荧光定量PCR反应 | 第39页 |
| 2.2.15 植物总蛋白的提取 | 第39-40页 |
| 2.2.16 Westernblot | 第40-41页 |
| 2.2.16.1 SDS-PAGE电泳 | 第40页 |
| 2.2.16.2 转膜 | 第40-41页 |
| 2.2.16.3 抗体的孵育 | 第41页 |
| 2.2.17 植物基因组DNA的提取 | 第41页 |
| 2.2.18 农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草 | 第41-42页 |
| 2.2.19 植物二氨基联苯胺组织化学染色 | 第42-43页 |
| 2.2.20 植物台盼蓝组织化学染色 | 第43页 |
| 2.2.21 点突变实验 | 第43-44页 |
| 2.2.22 植物GUS组织化学染色 | 第44页 |
| 2.2.23 植物总miRNA的合成 | 第44页 |
| 2.2.24 植物miRNA的qRT-RCR反应 | 第44-45页 |
| 2.2.25 酵母感受态细胞的制备 | 第45-46页 |
| 2.2.26 酵母感受态细胞的转化 | 第46页 |
| 2.2.27 诱饵载体的自激活活性及毒性检测 | 第46-47页 |
| 2.2.28 棉花酵母双杂交文库cDNA的合成 | 第47-48页 |
| 2.2.28.1 文库cDNA第一链的合成 | 第47页 |
| 2.2.28.2 利用LongdistancePCR扩大cDNA | 第47-48页 |
| 2.2.28.3 利用CHROMASPINTM+TE-400柱纯化dscDNA | 第48页 |
| 2.2.29 棉花酵母双杂交文库的构建 | 第48-49页 |
| 2.2.29.1 dscDNA与pGADT7-Rec载体同源重组 | 第48-49页 |
| 2.2.29.2 棉花酵母双杂交文库的制备 | 第49页 |
| 2.2.30 酵母双杂交筛库 | 第49-50页 |
| 2.2.31 捕获蛋白的鉴定 | 第50-51页 |
| 2.2.32 酵母双杂交筛库结果验证 | 第51-52页 |
| 3 结果与分析 | 第52-88页 |
| 3.1 棉花GhMKK6基因的生物学功能分析 | 第52-65页 |
| 3.1.1 棉花GhMKK6基因的亚细胞定位分析 | 第52-53页 |
| 3.1.2 棉花GhMKK6基因的表达模式分析 | 第53-54页 |
| 3.1.3 GhMKK6基因沉默棉花的获得与鉴定 | 第54-55页 |
| 3.1.4 GhMKK6基因沉默棉花的功能分析 | 第55-57页 |
| 3.1.4.1 GhMKK6基因沉默棉花对枯萎病菌的抗性分析 | 第55-56页 |
| 3.1.4.2 GhMKK6基因沉默棉花中抗性相关基因的表达模式分析 | 第56-57页 |
| 3.1.5 超表达GhMKK6转基因烟草的获得与鉴定 | 第57-59页 |
| 3.1.5.1 GhMKK6转基因烟草的鉴定 | 第57-58页 |
| 3.1.5.2 GhMKK6超表达对下游MAPKs基因的影响 | 第58-59页 |
| 3.1.6 GhMKK6转基因烟草对枯萎病菌的抗性分析 | 第59-60页 |
| 3.1.7 不同活性GhMKK6对烟草抗病性的影响 | 第60-65页 |
| 3.1.7.1 不同活性GhMKK6对下游MAPKs基因的影响 | 第60-61页 |
| 3.1.7.2 组成型激活GhMKK6造成叶片类病斑表型 | 第61-63页 |
| 3.1.7.3 瞬时侵染不同活性GhMKK6对植物抗病性的影响 | 第63-65页 |
| 3.2 棉花ghr-miR5272a对GhMKK6基因的表达调控 | 第65-72页 |
| 3.2.1 GhMKK6与ghr-miR5272a之间的碱基互补配对情况 | 第65页 |
| 3.2.2 GhMKK6是ghr-miR5272a的靶基因 | 第65-66页 |
| 3.2.3 ghr-miR5272a的表达模式分析 | 第66-67页 |
| 3.2.4 ghr-miR5272a沉默棉花的获得与鉴定 | 第67-68页 |
| 3.2.5 ghr-miR5272a沉默棉花中抗性相关基因的表达模式分析 | 第68-69页 |
| 3.2.6 ghr-miR5272a超表达棉花的获得与鉴定 | 第69-70页 |
| 3.2.7 ghr-miR5272a超表达棉花的功能分析 | 第70-72页 |
| 3.3 棉花GhMKK6互作蛋白的筛选 | 第72-77页 |
| 3.3.1 诱饵载体GhMKK6-BD的构建 | 第72页 |
| 3.3.2 GhMKK6-BD的毒性及自激活检测 | 第72-73页 |
| 3.3.3 棉花酵母双杂交文库的获得 | 第73-75页 |
| 3.3.3.1 棉花总RNA的提取及cDNA的合成 | 第73-74页 |
| 3.3.3.2 棉花酵母双杂交文库质量及库容检测结果 | 第74-75页 |
| 3.3.4 酵母双杂交文库的筛选 | 第75页 |
| 3.3.5 捕获蛋白的鉴定 | 第75-77页 |
| 3.4 棉花GhMORG1基因的克隆及功能分析 | 第77-88页 |
| 3.4.1 棉花WD40结构域重复蛋白基因的获得及序列分析 | 第77-78页 |
| 3.4.2 棉花GhMORG1蛋白结构分析 | 第78-79页 |
| 3.4.3 棉花GhMORG1与GhMKK6互作关系验证及亚细胞定位分析 | 第79-82页 |
| 3.4.4 棉花GhMORG1基因的表达模式分析 | 第82页 |
| 3.4.5 GhMORG1沉默棉花的获得与生物学功能分析 | 第82-85页 |
| 3.4.6 超表达GhMORG1转基因烟草的获得与鉴定 | 第85-86页 |
| 3.4.7 GhMORG1转基因烟草对枯萎病菌的抗性分析 | 第86-88页 |
| 4 讨论 | 第88-95页 |
| 4.1 GhMKK6介导的MAPK级联信号通路调控了棉花对枯萎病菌的抗性 | 第88-90页 |
| 4.2 ghr-miR5272a通过抑制GhMKK6的表达调控MAPK级联信号通路 | 第90-92页 |
| 4.3 棉花MAPK支架蛋白GhMORG1对MAPK级联信号通路的调控 | 第92-95页 |
| 5 结论 | 第95-96页 |
| 参考文献 | 第96-107页 |
| 致谢 | 第107-108页 |
| 攻读学位期间发表的论文及成果 | 第108页 |
