论文目录 | |
| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-12页 |
| 英文略缩语 | 第12-22页 |
| 第一部分：环状RNAcirc-MFN2与circ-LDLRAD3作为胰腺癌新型诊断生物标志物的研究 | 第22-62页 |
| 1 前言 | 第22-23页 |
| 2 材料和方法 | 第23-33页 |
| 2.1 主要试剂和仪器 | 第23-25页 |
| 2.1.1 主要材料与试剂 | 第23-24页 |
| 2.1.2 主要仪器 | 第24-25页 |
| 2.2 步骤与方法 | 第25-33页 |
| 2.2.1 组织和血浆标本收集与临床病理资料整理 | 第25页 |
| 2.2.2 细胞培养与传代 | 第25-26页 |
| 2.2.3 组织标本的RNA提取 | 第26-27页 |
| 2.2.4 细胞样本的RNA提取 | 第27页 |
| 2.2.5 血浆标本的RNA提取 | 第27-28页 |
| 2.2.6 测定RNA浓度和纯度 | 第28页 |
| 2.2.7 RNA完整性检测 | 第28-29页 |
| 2.2.8 RNA反转录成cDNA | 第29-30页 |
| 2.2.9 测定cDNA浓度和纯度 | 第30页 |
| 2.2.10 qRT-PCR反应 | 第30-31页 |
| 2.2.11 qRT-PCR产物验证 | 第31页 |
| 2.2.12 Sanger测序 | 第31-32页 |
| 2.2.13 血液CA19-9和CEA测定 | 第32页 |
| 2.2.14 统计学分析 | 第32-33页 |
| 3 结果 | 第33-59页 |
| 3.1 提取RNA的质量验证 | 第33-34页 |
| 3.2 验证circ-MFN2和circ-LDLRAD3的Divergent引物的特异性 | 第34-35页 |
| 3.3 circ-MFN2和circ-LDLRAD3在不同胰腺及胰腺癌细胞系中的表达情况 | 第35-38页 |
| 3.3.1 circ-MFN2在不同胰腺及胰腺癌细胞系中的表达情况 | 第35-36页 |
| 3.3.2 circ-LDLRAD3在不同胰腺细胞系中的表达情况 | 第36-38页 |
| 3.4 circ-MFN2和circ-LDLRAD3在胰腺癌组织与胰腺癌癌旁组织中表达情况 | 第38-39页 |
| 3.4.1 circ-MFN2在胰腺癌组织与胰腺癌癌旁组织中表达情况 | 第38页 |
| 3.4.2 circ-LDLRAD3在胰腺癌组织与胰腺癌癌旁组织中表达情况 | 第38-39页 |
| 3.5 circ-MFN2和circ-LDLRAD3在胰腺癌病人血液及健康志愿者血液中表达情况 | 第39-40页 |
| 3.5.1 circ-MFN2在胰腺癌病人血液及健康志愿者血液中表达情况 | 第39-40页 |
| 3.5.2 circ-LDLRAD3在胰腺癌病人血液及健康志愿者血液中表达情况 | 第40页 |
| 3.6 circ-MFN2和circ-LDLRAD3表达情况与临床病理资料相关性分析 | 第40-57页 |
| 3.6.1 circ-MFN2在胰腺癌病人组织中的表达情况与临床病理资料相关性分析 | 第40-44页 |
| 3.6.2 circ-LDLRAD3在胰腺癌病人组织中的表达情况与临床病理资料相关性分析 | 第44-49页 |
| 3.6.3 circ-MFN2在胰腺癌病人血液中的表达情况与临床病理资料相关性分析 | 第49-53页 |
| 3.6.4 circ-LDLRAD3在胰腺癌病人血液中的表达情况与临床病理资料相关性分析 | 第53-57页 |
| 3.7 circ-MFN2和circ-LDLRAD3作为胰腺癌新型潜在诊断标志物的分析 | 第57-59页 |
| 3.7.1 circ-MFN2作为胰腺癌新型潜在诊断生物标志物的分析 | 第57页 |
| 3.7.2 circ-LDLRAD3作为胰腺癌新型潜在诊断生物标志物的分析 | 第57-59页 |
| 4 讨论 | 第59-61页 |
| 5 结论 | 第61-62页 |
| 第二部分：基于高通量测序的胰腺癌差异microRNA的鉴定与分析 | 第62-87页 |
| 6 前言 | 第62-63页 |
| 7 材料和方法 | 第63-68页 |
| 7.1 主要试剂和仪器 | 第63-64页 |
| 7.1.1 主要材料与试剂 | 第63-64页 |
| 7.1.2 主要仪器 | 第64页 |
| 7.2 步骤与方法 | 第64-68页 |
| 7.2.1 组织和血浆标本收集 | 第64页 |
| 7.2.2 建库测序流程 | 第64-65页 |
| 7.2.3 测序数据过滤 | 第65页 |
| 7.2.4 生物信息分析流程 | 第65-66页 |
| 7.2.5 组织与细胞标本miRNA提取 | 第66-67页 |
| 7.2.6 miRNA反转录与qRT-PCR反应 | 第67-68页 |
| 7.2.7 统计学分析 | 第68页 |
| 8 结果 | 第68-84页 |
| 8.1 测序数据质量评估 | 第68-72页 |
| 8.1.1 测序错误率分布检查 | 第68-69页 |
| 8.1.2 测序数据质量情况汇总 | 第69-70页 |
| 8.1.3 测序数据过滤 | 第70-71页 |
| 8.1.4 sRNA长度筛选 | 第71-72页 |
| 8.2 参考序列比对分析 | 第72页 |
| 8.3 分类注释 | 第72-76页 |
| 8.3.1 已知miRNA分析 | 第72-74页 |
| 8.3.2 新miRNA预测 | 第74-76页 |
| 8.4 miRNA表达及差异分析 | 第76-81页 |
| 8.4.1 miRNA表达水平分析 | 第76-77页 |
| 8.4.2 miRNA表达量TPM密度分布图 | 第77页 |
| 8.4.3 样品间相关性检查 | 第77-78页 |
| 8.4.4 miRNA差异表达分析结果 | 第78页 |
| 8.4.5 差异miRNA筛选 | 第78-79页 |
| 8.4.6 差异miRNA聚类分析 | 第79-80页 |
| 8.4.7 差异miRNA韦恩图 | 第80-81页 |
| 8.5 circRNA结合位点及靶基因预测分析 | 第81页 |
| 8.6 差异miRNA—miR-133a-3p在胰腺癌中表达情况的验证 | 第81-84页 |
| 8.6.1 miR-133a-3p在胰腺癌细胞中的表达情况 | 第81-83页 |
| 8.6.2 miR-133a-3p在胰腺癌组织与胰腺癌癌旁组织中表达情况 | 第83-84页 |
| 9 讨论 | 第84-86页 |
| 10 结论 | 第86-87页 |
| 第三部分：circ-MFN2—miR-133a-3p—SLC39A4调控网络对胰腺癌发生发展的作用机制研究 | 第87-150页 |
| 11 前言 | 第87-88页 |
| 12 实验材料与方法 | 第88-100页 |
| 12.1 主要试剂和仪器 | 第88-90页 |
| 12.1.1 主要材料与试剂 | 第88-90页 |
| 12.1.2 主要仪器 | 第90页 |
| 12.2 .步骤与方法 | 第90-100页 |
| 12.2.1 细胞RNA核浆分离 | 第90-92页 |
| 12.2.2 circ-MFN2过表达与干扰慢病毒构建 | 第92-93页 |
| 12.2.3 circ-MFN2过表达及干扰稳转株构建 | 第93页 |
| 12.2.4 转染过表达miR-133a-3p(pre-miR-133a-3p)及干扰miR-133a-3p(anti-miR-133a-3p)片段 | 第93-94页 |
| 12.2.5 转染过表达及干扰SLC39A4质粒 | 第94-95页 |
| 12.2.6 CCK8实验检测细胞增殖 | 第95页 |
| 12.2.7 Transwell实验检测细胞侵袭能力 | 第95-96页 |
| 12.2.8 划痕实验检测细胞迁移 | 第96页 |
| 12.2.9 流式细胞术检测细胞凋亡 | 第96页 |
| 12.2.10 流式细胞术检测细胞周期 | 第96页 |
| 12.2.11 WesternBlot检测蛋白表达情况 | 第96-97页 |
| 12.2.12 双荧光素酶实验 | 第97-100页 |
| 12.2.13 核浆分离及SLC39A4的RNA水平表达情况检测 | 第100页 |
| 12.2.14 裸鼠种瘤 | 第100页 |
| 12.2.15 统计学处理 | 第100页 |
| 13 结果 | 第100-147页 |
| 13.1 SLC39A4在不同胰腺癌细胞中的表达情况 | 第100-101页 |
| 13.2 circ-MFN2与SLC39A4的细胞内细胞核及细胞浆表达情况 | 第101-104页 |
| 13.2.1 BxPC-3细胞内circ-MFN2和SLC39A4的细胞核及细胞浆表达情况 | 第101-102页 |
| 13.2.2 PANC-1细胞内circ-MFN2和SLC39A4的细胞核及细胞浆表达情况 | 第102-103页 |
| 13.2.3 SW1990细胞内circ-MFN2和SLC39A4的细胞核及细胞浆表达情况 | 第103-104页 |
| 13.3 过表达和敲减circ-MFN2后对胰腺癌细胞生物学行为的影响 | 第104-114页 |
| 13.3.1 慢病毒转染circ-MFN2过表达和干扰载体效率验证 | 第104-106页 |
| 13.3.2 过表达和敲减circ-MFN2后CCK8检测细胞增殖 | 第106-107页 |
| 13.3.3 过表达和敲减circ-MFN2后Transwell检测细胞侵袭 | 第107-108页 |
| 13.3.4 过表达和敲减circ-MFN2后细胞划痕检测细胞迁移 | 第108-110页 |
| 13.3.5 过表达和敲减circ-MFN2后流式细胞术检测细胞凋亡 | 第110-111页 |
| 13.3.6 过表达和敲减circ-MFN2后流式细胞术检测细胞周期变化 | 第111-112页 |
| 13.3.7 过表达和敲减circ-MFN2后WesternBlot检测凋亡、侵袭等关键蛋白变化 | 第112-114页 |
| 13.4 过表达和敲减miR-133a-3p后对胰腺癌细胞生物学行为的影响 | 第114-123页 |
| 13.4.1 转染miR-133a-3p过表达和干扰载体效率验证 | 第114-115页 |
| 13.4.2 过表达和敲减miR-133a-3p后CCK8检测细胞增殖 | 第115-116页 |
| 13.4.3 过表达和敲减miR-133a-3p后Transwell检测细胞侵袭 | 第116-117页 |
| 13.4.4 过表达和敲减miR-133a-3p后细胞划痕检测细胞迁移 | 第117-119页 |
| 13.4.5 过表达和敲减miR-133a-3p后流式细胞术检测细胞凋亡 | 第119-120页 |
| 13.4.6 过表达和敲减miR-133a-3p后流式细胞术检测细胞周期变化 | 第120-121页 |
| 13.4.7 过表达和敲减miR-133a-3p后WesternBlot检测凋亡、侵袭等关键蛋白变化 | 第121-123页 |
| 13.5 circ-MFN2与miR-133a-3p的结合及互作验证 | 第123-126页 |
| 13.5.1 双荧光素酶报告基因验证circ-MFN2与miR-133a-3p的结合 | 第123-124页 |
| 13.5.2 过表达和敲减circ-MFN2后miR-133a-3p的表达情况 | 第124-125页 |
| 13.5.3 过表达和敲减miR-133a-3p后circ-MFN2的表达情况 | 第125-126页 |
| 13.6 共转circ-MFN2及miR-133a-3p后对胰腺癌细胞生物学行为影响 | 第126-136页 |
| 13.6.1 共转circ-MFN2及miR-133a-3p后CCK8检测细胞增殖 | 第126-128页 |
| 13.6.2 共转circ-MFN2及miR-133a-3p后Transwell检测细胞侵袭 | 第128-129页 |
| 13.6.3 共转circ-MFN2及miR-133a-3p后细胞划痕检测细胞迁移 | 第129-131页 |
| 13.6.4 共转circ-MFN2及miR-133a-3p后流式细胞术检测细胞凋亡 | 第131-133页 |
| 13.6.5 共转circ-MFN2及miR-133a-3p后流式细胞术检测细胞周期变化 | 第133-134页 |
| 13.6.6 共转circ-MFN2及miR-133a-3p后WesternBlot检测凋亡、侵袭等关键蛋白变化 | 第134-136页 |
| 13.7 miR-133a-3p与SLC39A4的结合及互作验证 | 第136-142页 |
| 13.7.1 双荧光素酶报告基因验证miR-133a-3p与SLC39A4的结合 | 第136-137页 |
| 13.7.2 过表达和敲减circ-MFN2后SLC39A4的表达情况 | 第137-139页 |
| 13.7.3 过表达和敲减miR-133a-3p后SLC39A4的表达情况 | 第139-140页 |
| 13.7.4 共转circ-MFN2及miR-133a-3p后SLC39A4的表达情况 | 第140-142页 |
| 13.8 过表达和敲减SLC39A4后对胰腺癌细胞信号通路的影响 | 第142-145页 |
| 13.8.1 转染SLC39A4过表达和干扰载体效率验证 | 第142-143页 |
| 13.8.2 过表达和敲减SLC39A4后胰腺癌细胞MAPK/ERK及Smad2/3/Smad4通路影响 | 第143-145页 |
| 13.9 体外动物实验明确circ-MFN2对胰腺癌影响 | 第145-147页 |
| 14 讨论 | 第147-149页 |
| 15 结论 | 第149-150页 |
| 本研究创新性的自我评价 | 第150-151页 |
| 参考文献 | 第151-158页 |
| 综述 | 第158-177页 |
| 参考文献 | 第169-177页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第177-178页 |
| 致谢 | 第178-179页 |
| 个人简历 | 第179页 |
