论文目录 | |
| 符号说明 | 第1-12页 |
| 摘要 | 第12-15页 |
| Abstract | 第15-19页 |
| 1 前言 | 第19-31页 |
| 1.1 植物与糖 | 第19-22页 |
| 1.1.1 糖的作用 | 第19-20页 |
| 1.1.2 糖转运蛋白 | 第20-22页 |
| 1.1.2.1 蔗糖转运蛋白 | 第20-21页 |
| 1.1.2.2 单糖类转运蛋白 | 第21-22页 |
| 1.2 植物与苹果酸 | 第22-23页 |
| 1.2.1 苹果酸 | 第22页 |
| 1.2.2 苹果酸转运蛋白 | 第22-23页 |
| 1.3 非生物胁迫 | 第23-27页 |
| 1.3.1 植物激素ABA | 第23-24页 |
| 1.3.2 盐胁迫 | 第24-25页 |
| 1.3.3 干旱胁迫 | 第25-26页 |
| 1.3.4 重金属胁迫 | 第26页 |
| 1.3.5 蛋白激酶(CIPKs) | 第26-27页 |
| 1.4 糖与非生物胁迫 | 第27-29页 |
| 1.5 有机酸与镉(Cd)胁迫 | 第29-30页 |
| 1.6 研究的目的和意义 | 第30-31页 |
| 2 材料和方法 | 第31-58页 |
| 2.1 实验材料 | 第31-36页 |
| 2.1.1 苹果材料 | 第31页 |
| 2.1.2 拟南芥及其生长条件 | 第31页 |
| 2.1.3 酵母及其生长条件 | 第31页 |
| 2.1.4 菌株 | 第31-32页 |
| 2.1.5 载体 | 第32页 |
| 2.1.6 引物 | 第32页 |
| 2.1.7 所用药品试剂 | 第32-33页 |
| 2.1.8 培养基 | 第33-35页 |
| 2.1.9 缓冲液配方 | 第35-36页 |
| 2.2 实验方法 | 第36-58页 |
| 2.2.1 植物总RNA的提取 | 第36页 |
| 2.2.2 RNA含量与纯度检测 | 第36-37页 |
| 2.2.3 去除基因组DNA | 第37页 |
| 2.2.4 基因克隆 | 第37-38页 |
| 2.2.5 PCR产物回收 | 第38页 |
| 2.2.6 连接反应 | 第38-39页 |
| 2.2.7 制备和转化大肠杆菌感受态 | 第39页 |
| 2.2.8 测序 | 第39页 |
| 2.2.9 质粒的提取 | 第39-40页 |
| 2.2.10 质粒DNA的酶切反应 | 第40页 |
| 2.2.11 构建表达载体 | 第40-43页 |
| 2.2.11.1 构建MdSUT2.2、MdCIPK13、MdCIPK22、MdAREB2、MdALMT14表达载体 | 第40-41页 |
| 2.2.11.2 MdSUT2.2、MdCIPK13、MdCIPK22、MdAREB2、MdALMT14瞬时沉默表达载体的构建 | 第41页 |
| 2.2.11.3 用于发根农杆菌侵染的pK7GWIWG2载体构建 | 第41-42页 |
| 2.2.11.4 构建启动子载体 | 第42页 |
| 2.2.11.5 构建原核表达载体 | 第42-43页 |
| 2.2.11.6 构建酵母双杂交载体 | 第43页 |
| 2.2.12 制备与转化农杆菌感受态 | 第43-44页 |
| 2.2.13 准备及转化植物材料 | 第44-46页 |
| 2.2.13.1 培养苹果王林愈伤组织组织 | 第44页 |
| 2.2.13.2 转化苹果愈伤组织组织的过程 | 第44页 |
| 2.2.13.3 ‘Gala’苹果遗传转化 | 第44-45页 |
| 2.2.13.4 发根农杆菌MSU440侵染 | 第45-46页 |
| 2.2.14 酵母双杂 | 第46-47页 |
| 2.2.14.1 所用相关试剂及配制方法 | 第46页 |
| 2.2.14.2 酵母双杂交步骤 | 第46-47页 |
| 2.2.15 蛋白相关的实验技术 | 第47-50页 |
| 2.2.15.1 原核诱导蛋白 | 第47-48页 |
| 2.2.15.2 原核诱导蛋白纯化 | 第48页 |
| 2.2.15.3 Pull-Down | 第48-49页 |
| 2.2.15.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第49-50页 |
| 2.2.16 植物总蛋白的提取 | 第50页 |
| 2.2.17 蛋白的免疫印迹分析(Westernblotting) | 第50-51页 |
| 2.2.17.1 转膜 | 第50-51页 |
| 2.2.17.2 洗膜和显影 | 第51页 |
| 2.2.18 蛋白体外降解 | 第51页 |
| 2.2.19 Co-IP免疫共沉淀 | 第51-52页 |
| 2.2.20 蛋白磷酸化检测 | 第52-53页 |
| 2.2.20.1 蛋白离体磷酸化的鉴定(放射性32P同位素标记) | 第52-53页 |
| 2.2.20.2 体内蛋白磷酸化的检测(Pro-QDiamondPhosphoproteinGelStain) | 第53页 |
| 2.2.21 苹果原生质体的提取 | 第53-55页 |
| 2.2.21.1 原生质体的分离 | 第53-54页 |
| 2.2.21.2 PEG转化 | 第54-55页 |
| 2.2.22 脯氨酸含量测定 | 第55页 |
| 2.2.23 MDA含量测定 | 第55页 |
| 2.2.24 测定GUS酶活 | 第55-58页 |
| 2.2.24.1 试剂的配制 | 第55-56页 |
| 2.2.24.2 植物材料GUS蛋白的提取 | 第56页 |
| 2.2.24.3 GUS活性的测定 | 第56-58页 |
| 3 结果与分析 | 第58-107页 |
| 3.1 MdSUT2.2功能初步鉴定 | 第58-63页 |
| 3.1.1 MdSUT2.2克隆 | 第58-60页 |
| 3.1.2 异位表达MdSUT2.2的拟南芥表现为早花和植株高度增加的表型 | 第60-61页 |
| 3.1.3 MdSUT2.2响应非生物胁迫 | 第61-63页 |
| 3.2 转录因子MdAREB2调控基因MdSUT2.2的表达 | 第63-73页 |
| 3.2.1 糖转运蛋白MdTMT1和MdSUT2.2参与调控ABA诱导的糖积累的过程 | 第63-64页 |
| 3.2.2 MdSUT2.2作为蔗糖转运蛋白 | 第64-65页 |
| 3.2.3 ABA顺式作用元件ABRE是ABA诱导MdSUT2.2表达必需的 | 第65-66页 |
| 3.2.4 转录因子MdAREB2绑定到糖转运蛋白和淀粉酶基因的启动子上 | 第66-69页 |
| 3.2.5 过量表达MdAREB2促进可溶性糖和蔗糖积累 | 第69-70页 |
| 3.2.6 MdAREB2通过MdSUT2.2调控糖积累 | 第70-71页 |
| 3.2.7 在果实中,MdAREB2激活MdSUT2.2影响糖积累 | 第71-73页 |
| 3.3 MdCIPK22与MdAREB2相互作用并发生磷酸化 | 第73-81页 |
| 3.3.1 苹果MdAREB2基因的过表达增加ABA敏感性 | 第73-75页 |
| 3.3.2 ABA诱导MdAREB2蛋白在Thr411位点发生磷酸化 | 第75-76页 |
| 3.3.3 MdCIPK22与MdAREB2互作 | 第76-77页 |
| 3.3.4 ABA诱导MdAREB2磷酸化需要MdCIPK | 第77-79页 |
| 3.3.5 磷酸化稳定MdAREB2蛋白并增强其转录活性 | 第79-80页 |
| 3.3.6 MdCIPK22调控ABA敏感性通过MdAREB | 第80-81页 |
| 3.4 蔗糖转运蛋白MdSUT2.2参与干旱胁迫并发生磷酸化 | 第81-89页 |
| 3.4.1 过量表达MdSUT2.2提高苹果干旱抗性 | 第81-82页 |
| 3.4.2 在干旱条件下,MdSUT2.2蛋白发生磷酸化 | 第82-84页 |
| 3.4.3 MdSUT2.2和MdCIPK22互作 | 第84-85页 |
| 3.4.4 蛋白MdSUT2.2磷酸化需要MdCIPK | 第85-86页 |
| 3.4.5 干旱下MdCIPK22稳定MdSUT2.2蛋白 | 第86-87页 |
| 3.4.6 MdCIPK22通过MdSUT2.2提高干旱抗性 | 第87-89页 |
| 3.5 MdSUT2.2与MdCIPK13互作,被MdCIPK13磷酸化 | 第89-98页 |
| 3.5.1 过量表达MdSUT2.2提高盐抗性 | 第89-90页 |
| 3.5.2 盐诱导MdSUT2.2磷酸化 | 第90-92页 |
| 3.5.3 MdSUT2.2和MdCIPK13互作 | 第92-93页 |
| 3.5.4 MdCIPK13影响MdSUT2.2磷酸化 | 第93-94页 |
| 3.5.5 MdCIPK13稳定MdSUT2.2蛋白 | 第94-95页 |
| 3.5.6 MdCIPK13通过MdSUT2.2提高盐抗性 | 第95-98页 |
| 3.6 MdSOS2L1与MdALMT14相互作用,提高苹果对重金属的耐受性 | 第98-106页 |
| 3.6.1 过量表达MdSOS2L1提高植株对镉抗性 | 第98-99页 |
| 3.6.2 MdSOS2L1与MdALMT14互作 | 第99-101页 |
| 3.6.3 过表达MdALMT14植株提高对于Cd抗性 | 第101-102页 |
| 3.6.4 Cd2+诱导MdALMT14发生磷酸化 | 第102页 |
| 3.6.5 MdSOS2L1影响MdALMT14磷酸化 | 第102-103页 |
| 3.6.6 MdSOS2L1稳定MdALMT14蛋白 | 第103-104页 |
| 3.6.7 MdSOS2L1通过MdALMT14提高重金属抗性 | 第104-106页 |
| 3.7 MdSUT2.2参与调控糖积累和非生物胁迫以及MdALMT14参与重金属胁迫的模式图 | 第106-107页 |
| 4 讨论 | 第107-119页 |
| 4.1 MdSUT2.2调控植物的生长与发育 | 第107-108页 |
| 4.2 MdAREB2在ABA信号途径中的作用 | 第108-110页 |
| 4.3 MdAREB2通过调控MdSUT2.2的表达参与糖信号 | 第110-112页 |
| 4.4 MdCIPK22与MdSUT2.2互作,参与调控干旱胁迫 | 第112-114页 |
| 4.5 MdCIPK13与MdSUT2.2互作,参与调控盐胁迫 | 第114-116页 |
| 4.6 MdSOS2L1通过MdALMT14调控重金属的抗性 | 第116-119页 |
| 5 结论 | 第119-120页 |
| 6 参考文献 | 第120-139页 |
| 7 附录 | 第139-145页 |
| 7.1 本文所用引物 | 第139-142页 |
| 7.2 本文所用载体示意图 | 第142-145页 |
| 8 致谢 | 第145-146页 |
| 9 攻读学位期间发表的论文 | 第146-147页 |
