论文目录 | |
| 摘 要 | 第1-6
页 |
| ABSTRACT | 第6-14
页 |
| 第一章、 综述 | 第14-37
页 |
| 1. 鱼类 MSTN 基因的研究进展 | 第14-20
页 |
| · 鱼类 MSTN 基因的分子结构 | 第15-16
页 |
| · 鱼类 MSTN 的不同基因型 | 第16-17
页 |
| · 鱼类 MSTN 基因的表达 | 第17-18
页 |
| · 不同组织的表达 | 第17-18
页 |
| · 不同发育时期的表达 | 第18
页 |
| · 鱼类 MSTN 基因的功能分析 | 第18-19
页 |
| · 鱼类 MSTN 基因与其他基因的互作关系 | 第19
页 |
| · 鱼类 MSTN 基因的微卫星标记及多态性 | 第19-20
页 |
| · MSTN 基因研究的意义及前景展望 | 第20
页 |
| 2. 鱼类胚胎干细胞及其介导的遗传操作研究进展 | 第20-25
页 |
| · 斑马鱼胚胎干细胞 | 第22-23
页 |
| · 青鳉胚胎干细胞 | 第23-24
页 |
| · 金鲷胚胎干细胞 | 第24
页 |
| · 花鲈和真鲷胚胎干细胞 | 第24-25
页 |
| · 大菱鲆胚胎干细胞 | 第25
页 |
| 3. 基因打靶技术的发展及操作方法 | 第25-34
页 |
| · 基因打靶技术的原理 | 第25-26
页 |
| · Holliday 双链侵入模型 | 第25-26
页 |
| · 单链侵入模型 | 第26
页 |
| · 双链断裂修复模型 | 第26
页 |
| · 基因打靶技术的操作方法 | 第26-34
页 |
| · 同源重组载体构建 | 第27-31
页 |
| · 基因打靶载体的类型 | 第27-29
页 |
| · 基因打靶载体构建的策略 | 第29-31
页 |
| · 打靶载体转化受体细胞的方法 | 第31-32
页 |
| · 磷酸钙共沉淀法 | 第31-32
页 |
| · 脂质体法 | 第32
页 |
| · 电穿孔法 | 第32
页 |
| · 同源重组阳性细胞的筛选 | 第32-34
页 |
| · 正向选择法(positive selection) | 第32-33
页 |
| · 正负选择法(positive and negative selection) | 第33-34
页 |
| · 同源重组的胚胎干细胞克隆的鉴定方法 | 第34
页 |
| · PCR 初步鉴定重组阳性细胞 | 第34
页 |
| · SOURTHERN BLOT 鉴定重组阳性细胞 | 第34
页 |
| · 同源重组阳性细胞向受体细胞的移植 | 第34
页 |
| 4. 鱼类基因打靶潜在的应用价值 | 第34-37
页 |
| · 鱼类基因功能分析的平台 | 第35
页 |
| · 提高鱼类的抗病力或生长 | 第35-36
页 |
| · 鱼类 MSTN 打靶研究的应用前景 | 第36-37
页 |
| 第二章、花鲈肌肉生长抑素（MSTN）基因的克隆和进化分析 | 第37-52
页 |
| 1. 材料和试剂 | 第38
页 |
| · 实验材料 | 第38
页 |
| · 实验试剂 | 第38
页 |
| 2 实验方法 | 第38-43
页 |
| · 花鲈基因组 DNA 的提取 | 第38
页 |
| · 花鲈肌肉生长抑制基因（MSTN）编码区序列的扩增 | 第38-39
页 |
| · 染色体步移克隆花鲈MSTN基因5’和3’侧翼序列 | 第39-42
页 |
| · 染色体步移扩增引物 | 第39-40
页 |
| · 花鲈基因组 DNA 的内切酶的完全消化 | 第40
页 |
| · 接头(Cassette)的连接反应 | 第40-41
页 |
| · BD GenomeWalker~(TM) Universal Kit 扩增MSTN 5’-UTR 区域 | 第41
页 |
| · LA PCR in vitro Cloning kit 扩增MSTN 3’-UTR 区域 | 第41-42
页 |
| · BD GenomeWalker~(TM) Universal Kit 再次扩增MSTN 3’-UTR 区域 | 第42
页 |
| · PCR 产物的分离、纯化及回收 | 第42
页 |
| · 花鲈肌肉生长抑制基因（MSTN）剪接连接点分析 | 第42-43
页 |
| · 序列分析和比对 | 第43
页 |
| 3 实验结果 | 第43-49
页 |
| · 花鲈MSTN基因的克隆及序列测定 | 第43-44
页 |
| · 花鲈MSTN基因的结构和序列分析 | 第44-45
页 |
| · 花鲈MSTN基因的氨基酸序列比对及同源性分析 | 第45-47
页 |
| · 花鲈肌肉生长抑素（MSTN）的进化分析 | 第47-49
页 |
| 4 讨论 | 第49-52
页 |
| 第三章、花鲈肌肉生长抑素基因（MSTN）的表达分析 | 第52-62
页 |
| 1、材料和方法 | 第53-56
页 |
| · 实验材料 | 第53
页 |
| · 实验试剂及质粒 | 第53
页 |
| · 花鲈组织及胚胎的收集 | 第53
页 |
| · 花鲈DNA及总RNA的提取 | 第53
页 |
| · 表达引物的设计 | 第53-54
页 |
| · 反转录第一链cDNA的合成 | 第54
页 |
| · PCR扩增 | 第54
页 |
| · GFP表达载体的构建 | 第54-55
页 |
| · 细胞的培养及脂质体介导的细胞转化 | 第55
页 |
| · 显微注射 | 第55-56
页 |
| 2、实验结果 | 第56-60
页 |
| · MSTN 基因在花鲈不同组织中的表达 | 第56
页 |
| · MSTN 基因在花鲈早期胚胎发育中的表达 | 第56-57
页 |
| · MSTN 基因在不同的细胞系中的表达 | 第57
页 |
| · 表达 GFP 载体的构建 | 第57-58
页 |
| · pMSTN-GFP 转化LJE51 细胞后的荧光观察 | 第58-59
页 |
| · pMSTN-GFP 在斑马鱼胚胎中的表达 | 第59-60
页 |
| 3. 讨论 | 第60-62
页 |
| 第四章、花鲈MSTN 同源重组载体的构建 | 第62-76
页 |
| 第一节、花鲈MSTN 基因1.5kb 及3.2kb 同源片段的扩增 | 第62-65
页 |
| 1 实验方法 | 第62-65
页 |
| · 花鲈MSTN 基因同源重组载体部分片段的引物设计 | 第62-63
页 |
| · 花鲈MSTN 基因同源长、短片段的PCR 扩增 | 第63-64
页 |
| · 1.5 Kb 同源短片段的扩增 | 第63-64
页 |
| · 3.2 Kb 同源长片段的扩增 | 第64
页 |
| · PCR 产物检测及回收 | 第64-65
页 |
| 2 实验结果 | 第65
页 |
| 第二节 花鲈 MSTN 基因同源重组载体的构建 | 第65-76
页 |
| 1 实验材料 | 第65
页 |
| 2 实验方法和结果 | 第65-74
页 |
| · 重组质粒P+M1.5的构建 | 第65-69
页 |
| · 乙醇纯化回收PCR 产物 | 第65-66
页 |
| · 酶切 PCR 产物及PBSKII+质粒 | 第66
页 |
| · 试剂盒纯化回收酶切产物 | 第66
页 |
| · 酶切产物的连接 | 第66-67
页 |
| · 连接产物的转化及筛选 | 第67-68
页 |
| · P+M1.5 连接质粒的鉴定 | 第68-69
页 |
| · 重组质粒 P+M1.5+M3.2 的构建 | 第69-70
页 |
| · 重组质粒P+M1.5+M3.2+neo 的构建(正选择基因的插入) | 第70-73
页 |
| · neo 片段的连接 | 第70-71
页 |
| · 重组质粒 P+M1.5+M3.2+neo 的转化、筛选和酶切鉴定 | 第71
页 |
| · 重组质粒 P+M1.5+M3.2+neo 的测序鉴定 | 第71-73
页 |
| · 重组质粒P+M1.5+M3.2+neo+TK 的构建(负选择基因tk 的插入) | 第73-74
页 |
| 3. 讨论 | 第74-76
页 |
| 第五章、三种脂质体介导的花鲈胚胎干细胞转化效率的比较研究 | 第76-85
页 |
| 1 材料和方法 | 第76-77
页 |
| · 质粒的制备 | 第76-77
页 |
| · 细胞培养 | 第77
页 |
| · 脂质体介导的细胞转化 | 第77
页 |
| · 表达检测及表达效率的统计 | 第77
页 |
| 2 实验结果 | 第77-82
页 |
| · DNA 与脂质体的比例对转化效率的影响 | 第77-79
页 |
| · DNA与脂质体的剂量对转化效率的影响 | 第79-80
页 |
| · 细胞接种时间对转化效率的影响 | 第80-81
页 |
| · 细胞接种初始密度对转染效率的影响 | 第81-82
页 |
| 3. 讨论 | 第82-85
页 |
| 第六章、表达绿色荧光蛋白基因的花鲈胚胎干细胞株的建立及其体外分化 | 第85-94
页 |
| 1. 材料和方法 | 第85-87
页 |
| · 质粒DNA的制备及细胞培养 | 第85-86
页 |
| · 脂质体介导的细胞转化 | 第86
页 |
| · 药物筛选 | 第86
页 |
| · 基因整合和表达的检测 | 第86
页 |
| · GFP阳性花鲈胚胎干细胞体外分化能力的测定 | 第86-87
页 |
| · GFP阳性花鲈胚胎干细胞形成拟胚体的能力 | 第87
页 |
| 2. 实验结果 | 第87-92
页 |
| · 表达GFP的LJE51细胞观察、筛选及单克隆阳性细胞株的建立 | 第87-88
页 |
| · GFP+ LJE51细胞的鉴定 | 第88-89
页 |
| · GFP+ LJE51细胞的体外分化能力 | 第89-91
页 |
| · GFP+ LJE51细胞形成拟胚体的能力 | 第91-92
页 |
| 3. 讨论 | 第92-94
页 |
| 第七章、MSTN 同源重组载体的筛选 | 第94-98
页 |
| 1 材料和方法 | 第94-95
页 |
| · 实验试剂配制 | 第94
页 |
| · 细胞培养 | 第94
页 |
| · MSTN 同源重组载体 DNA 的制备及酶切 | 第94
页 |
| · MSTN 同源重组载体 DNA 转化花鲈 ES 细胞 | 第94
页 |
| · 正-负选择效果的检测 | 第94-95
页 |
| 2. 实验结果 | 第95-96
页 |
| 3. 讨 论 | 第96-98
页 |
| 结论 | 第98-100
页 |
| 参考文献 | 第100-114
页 |
| 致谢 | 第114-115
页 |
| 附录：主要成果和发表相关论文 | 第115-116
页 |
