论文目录 | |
| 中文摘要 | 第1-6
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| 英文摘要 | 第6-11
页 |
| 1 绪论 | 第11-23
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| 1．1 引言 | 第11-12
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| 1．2 基因工程药物生产的基本过程 | 第12-13
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| 1．3 本文的主要研究内容 | 第13-19
页 |
| 1．3．1 国内外研究概况及开发变异新型IL（2的必要性 | 第14
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| 1．3．2 人IL（2的结构及理化性质 | 第14-18
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| 1．3．3 IL-2R及其基因结构 | 第18
页 |
| 1．3．4 IL-2生物学活性与IL-2R的相互关系 | 第18-19
页 |
| 1．4 本文的创新之处 | 第19-23
页 |
| 1．4．1 IL（2三突变位点的设计思想 | 第19-20
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| 1．4．2 选用巴斯德毕赤酵母系统（PichiaPastoris）表达IL（2和变异IL（2 | 第20-21
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| 1．4．3 建立一套用PichiaPastoris分泌表达的变异IL（2并利于工业化生产的纯化工艺 | 第21-23
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| 2 克隆、表达与纯化 | 第23-45
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| 2．1 材料与方法 | 第24-45
页 |
| 2．1．1 细胞株与质粒 | 第24
页 |
| 2．1．2 主要仪器 | 第24-25
页 |
| 2．1．3 主要试剂 | 第25-29
页 |
| 2．1．4 引物设计、合成及目的基因扩增 | 第29-32
页 |
| 2．1．5 限制性内切酶谱筛选重组子 | 第32-34
页 |
| 2．1．6 DNA序列分析 | 第34
页 |
| 2．1．7 将质粒（pPIC9K（IL（2（3m，pPIC9K）转入PichiaPastoris菌株KM71中 | 第34-36
页 |
| 2．1．8 G418筛选多拷贝工程菌 | 第36-37
页 |
| 2．1．9 三 突变体rhIL（2在KM71中的诱导表达及Western（blot检测 | 第37-40
页 |
| 2．1．10 工程菌发酵 | 第40
页 |
| 2．1．11 人rhIL（2的纯化 | 第40-41
页 |
| 2．1．12 rhIL（2活性测定 | 第41-44
页 |
| 2．1．13 蛋白质含量的测定—Bradford | 第44-45
页 |
| 3 结果 | 第45-65
页 |
| 3．1 PCR引物的设计、合成和目的基因扩增 | 第45-46
页 |
| 3．2 三 突变体人rIL（2（C125A/L18M/L19S）质粒的构建筛选及突变位点的序列分析 | 第46-53
页 |
| 3．2．1 重组子 | 第48
页 |
| 3．2．2 DNA序列分析 | 第48-53
页 |
| 3．3 CaCl2法转化大肠杆菌TOP10F（的结果 | 第53-54
页 |
| 3．4 限制性内切酶分析重组子结果 | 第54
页 |
| 3．5 碱变性法制备质粒DNA的结果 | 第54-55
页 |
| 3．6 用PichiaEasyCompTMtransformationKit转染KM71细胞 | 第55-56
页 |
| 3．7 G418筛选多拷贝阳性转化子的（His+MutS）结果 | 第56-58
页 |
| 3．8 突变体IL（2在KM71中的诱导表达结果及免疫印迹反应检测表达的结果 | 第58-59
页 |
| 3．9 hrIL（2的纯化结果 | 第59-62
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| 3．10 rhIL（2的活性测定结果 | 第62-65
页 |
| 4 讨论 | 第65-79
页 |
| 4．1 基因突变的PCR技术制备新型IL-2 | 第65-66
页 |
| 4．2 受体菌KM71和表达载体pPIC9K的选择 | 第66-69
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| 4．2．1 受体菌 | 第66-67
页 |
| 4．2．2 载体 | 第67-69
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| · 3 质粒在大肠杆菌中的转化以及在酵母细胞中的转化 | 第69-71
页 |
| 4．3．1 质粒在大肠杆菌中的转化 | 第69-70
页 |
| 4．3．2 质粒在酵母细胞中的转化 | 第70-71
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| · 4 筛选转化子 | 第71-72
页 |
| · 5 巴斯德毕赤酵母表达菌株的生长 | 第72-73
页 |
| · 6 测活方法的比较 | 第73-74
页 |
| · 7 纯化的设计思路 | 第74-77
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| 4．8 rhIL-2天然蛋白和突变蛋白的性质比较 | 第77-79
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| 结论 | 第79-81
页 |
| 致谢 | 第81-82
页 |
| 参考文献 | 第82-87
页 |
| 附录：攻博期间论文发表情况科技查新报告 | 第87-93页 |
