论文目录 | |
摘要 | 第1-12页 |
ABSTRACT | 第12-13页 |
第一章 绪论 | 第14-46页 |
1.1 手性氨基酸概述 | 第14-16页 |
1.1.1 手性氨基酸 | 第14页 |
1.1.2 手性氨基酸的制备方法 | 第14-16页 |
1.2 草铵膦概述 | 第16-28页 |
1.2.1 草铵膦的生化功能 | 第16-17页 |
1.2.2 DL-草铵膦的化学合成法 | 第17-20页 |
1.2.3 L-草铵膦的化学合成 | 第20-24页 |
1.2.4 L-草铵膦的生物合成 | 第24-28页 |
1.3 酰胺酶 | 第28-39页 |
1.3.1 酰胺酶简介与分类 | 第28-31页 |
1.3.2 酰胺酶的底物特异性与立体选择性 | 第31-36页 |
1.3.3 酰胺酶的筛选 | 第36-38页 |
1.3.4 酰胺酶的克隆表达 | 第38-39页 |
1.3.5 酰胺酶的分子改造 | 第39页 |
1.4 枯草芽孢杆菌表达系统 | 第39-43页 |
1.4.1 枯草芽孢杆菌 | 第39-40页 |
1.4.2 影响枯草芽孢杆菌表达因素简介 | 第40页 |
1.4.3 启动子 | 第40-42页 |
1.4.4 信号肽 | 第42-43页 |
1.5 课题研究意义和主要研究内容 | 第43-46页 |
1.5.1 课题立项依据和研究意义 | 第43页 |
1.5.2 研究内容 | 第43-46页 |
第二章 立体选择性酰胺酶的筛选 | 第46-72页 |
2.1 引言 | 第46-47页 |
2.2 材料与方法 | 第47-55页 |
2.2.1 主要实验试剂 | 第47页 |
2.2.2 菌种质粒及培养基 | 第47页 |
2.2.3 实验仪器与设备 | 第47-48页 |
2.2.4 高通量筛选方法的建立 | 第48-50页 |
2.2.5 立体选择性酰胺酶产生菌的筛选 | 第50-51页 |
2.2.6 产酶微生物菌株的鉴定 | 第51-52页 |
2.2.7 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备与质粒的转化 | 第52页 |
2.2.8 立体选择性酰胺酶基因的挖掘 | 第52页 |
2.2.9 重组质粒构建 | 第52-53页 |
2.2.10 酰胺酶全基因合成 | 第53-54页 |
2.2.11 重组酰胺酶的表达与酰胺酶粗酶制备 | 第54页 |
2.2.12 核酸与蛋白电泳 | 第54页 |
2.2.13 酰胺酶催化底物转化成L-PPT的转化率与e.e.值测定 | 第54页 |
2.2.14 L-草铵膦的含量与e.e.值分析 | 第54-55页 |
2.3 结果与讨论 | 第55-69页 |
2.3.1 高通量筛选方法的建立与验证 | 第55-60页 |
2.3.2 酰胺酶产生菌的筛选与鉴定 | 第60-63页 |
2.3.3 酰胺酶基因的挖掘 | 第63-66页 |
2.3.4 产酰胺酶菌株中酰胺酶基因的克隆 | 第66-67页 |
2.3.5 重组酰胺酶基因的分泌表达 | 第67-69页 |
2.4 本章小结 | 第69-72页 |
第三章 酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达 | 第72-90页 |
3.1 引言 | 第72-73页 |
3.2 材料与方法 | 第73-77页 |
3.2.1 主要实验试剂 | 第73页 |
3.2.2 菌株试剂及培养基 | 第73页 |
3.2.3 实验仪器及设备 | 第73页 |
3.2.4 枯草芽孢杆菌基因组提取 | 第73-74页 |
3.2.5 枯草芽孢杆菌内源启动子与信号肽引物设计 | 第74页 |
3.2.6 含有不同启动子质粒的构建 | 第74-76页 |
3.2.7 单启动子的筛选与表征 | 第76页 |
3.2.8 双启动子构建 | 第76页 |
3.2.9 具备高效分泌效率的信号肽的筛选 | 第76页 |
3.2.10 枯草芽孢杆菌的扩大培养 | 第76-77页 |
3.2.11 酰胺酶文库中酰胺酶的分泌表达 | 第77页 |
3.3 结果与分析 | 第77-88页 |
3.3.1 枯草芽孢杆菌内源启动子的筛选与表征 | 第77-82页 |
3.3.2 Bm-Ami在枯草芽孢杆菌内源性启动子作用下的活力测定与表征 | 第82-83页 |
3.3.3 Bm-Ami在枯草芽孢杆菌串联双启动子作用下的活力测定与表征 | 第83-85页 |
3.3.4 信号肽的筛选 | 第85-86页 |
3.3.5 Bm-Ami在5 L发酵罐中的扩大生产 | 第86-87页 |
3.3.6 酰胺酶文库中酰胺酶的分泌表达 | 第87-88页 |
3.4 本章小结 | 第88-90页 |
第四章 立体选择性酰胺酶的酶学性质分析 | 第90-110页 |
4.1 引言 | 第90页 |
4.2 材料与方法 | 第90-95页 |
4.2.1 主要实验试剂 | 第90-91页 |
4.2.2 菌种质粒及培养基 | 第91页 |
4.2.3 实验仪器与设备 | 第91页 |
4.2.4 立体选择性酰胺酶表达及纯化 | 第91-92页 |
4.2.5 重组酰胺酶酶活测定与蛋白含量测定 | 第92页 |
4.2.6 重组酰胺酶酶学性质的测定 | 第92-93页 |
4.2.7 酰胺酶动力学参数的测定 | 第93页 |
4.2.8 底物特异性 | 第93-95页 |
4.3 结果与分析 | 第95-108页 |
4.3.1 重组立体选择性酰胺酶的序列结构分析 | 第95-97页 |
4.3.2 重组立体选择性酰胺酶的系统发育分析 | 第97-98页 |
4.3.3 重组立体选择性酰胺酶的纯化 | 第98-100页 |
4.3.4 pH对酰胺酶酶活的影响及pH稳定性 | 第100-102页 |
4.3.5 温度对酰胺酶酶活的影响及温度稳定性 | 第102-103页 |
4.3.6 金属离子、特殊化学物质和有机溶剂对酶活的影响 | 第103-104页 |
4.3.7 动力学参数的测定 | 第104页 |
4.3.8 底物特异性 | 第104-108页 |
4.4 本章小结 | 第108-110页 |
第五章 重组酰胺酶的分子改造 | 第11-122页 |
5.1 引言 | 第110页 |
5.2 材料与方法 | 第110-114页 |
5.2.1 主要实验试剂 | 第110-111页 |
5.2.2 菌株、质粒及培养基 | 第111页 |
5.2.3 实验仪器与设备 | 第111页 |
5.2.4 酰胺酶Bm-Ami的同源建模 | 第111页 |
5.2.5 酰胺酶模型YBm-Ami的活性口袋预测及分析 | 第111页 |
5.2.6 酰胺酶突变文库的构建与筛选 | 第111-113页 |
5.2.7 酰胺酶突变体动力学参数的测定 | 第113页 |
5.2.8 酰胺酶突变体的分子对接分析 | 第113-114页 |
5.3 结果与讨论 | 第114-120页 |
5.3.1 酰胺酶同源建模及活性口袋预测及分析 | 第114-115页 |
5.3.2 酰胺酶突变文库的建立及筛选 | 第115-116页 |
5.3.3 组合突变和最优突变株的确立 | 第116页 |
5.3.4 动力学参数测定 | 第116-117页 |
5.3.5 酰胺酶突变体的分子对接分析 | 第117-120页 |
5.4 本章小结 | 第120-122页 |
第六章 立体选择性酰胺酶在L-草铵膦合成中的应用 | 第122-132页 |
6.1 引言 | 第122-123页 |
6.2 材料与方法 | 第123-125页 |
6.2.1 主要实验试剂 | 第123页 |
6.2.2 菌株、质粒及培养基 | 第123页 |
6.2.3 实验仪器及设备 | 第123页 |
6.2.4 生物催化剂的制备 | 第123页 |
6.2.5 底物rac-4-[羟基(甲基)膦酰基]-2-(2-苯乙酰基)-丁酸(rac-S)的合成 | 第123页 |
6.2.6 立体选择性酰胺酶催化底物合成L-草铵膦的条件研究 | 第123-124页 |
6.2.7 不同底物浓度的反应进程研究 | 第124页 |
6.2.8 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦 | 第124页 |
6.2.9 L-草铵膦的分离纯化 | 第124-125页 |
6.3 结果与讨论 | 第125-130页 |
6.3.1 Rac-S的合成 | 第125页 |
6.3.2 酰胺酶的制备 | 第125页 |
6.3.3 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦的条件优化 | 第125-127页 |
6.3.4 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦的反应进程研究 | 第127-128页 |
6.3.5 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦 | 第128-129页 |
6.3.6 L-草铵膦的分离纯化及D型底物的消旋化 | 第129页 |
6.3.7 L-草铵膦的表征 | 第129-130页 |
6.4 本章小结 | 第130-132页 |
第七章 结论与展望 | 第132-136页 |
7.1 结论 | 第132-134页 |
7.2 主要贡献与创新 | 第134页 |
7.3 展望 | 第134-136页 |
参考文献 | 第136-154页 |
附录 | 第154-184页 |
致谢 | 第184-186页 |
作者简介 | 第186-188页 |
1 作者简历 | 第186页 |
2 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第186-187页 |
3 参与的科研项目情况 | 第187页 |
4 发明专利 | 第187-188页 |
学位论文数据集 | 第188页 |