论文目录 | |
| 摘要 | 第1-7
页 |
| Abstract | 第7-10
页 |
| 目录 | 第10-14
页 |
| 第1章 文献综述 | 第14-36
页 |
| · 甾体化合物及其微生物转化 | 第14-20
页 |
| · 甾体化合物及甾体药物 | 第14-16
页 |
| · 甾体化合物的微生物转化 | 第16-20
页 |
| · 甾体化合物的微生物转化概述 | 第16-17
页 |
| · 甾体化合物微生物转化的反应类型 | 第17
页 |
| · 植物甾醇及甾醇侧链降解 | 第17-20
页 |
| · 3-甾酮-△~1-脱氢酶(KsdD) | 第20-24
页 |
| · 3-甾酮-△~1-脱氢反应概况 | 第20-21
页 |
| · 3-甾酮-△~1-脱氢酶的反应机理 | 第21-22
页 |
| · 3-甾酮-△~1-脱氢酶氨基酸序列分析 | 第22-23
页 |
| · 3-甾酮-△~1-脱氢酶的异源表达 | 第23-24
页 |
| · 3-甾酮-9A-羟基化酶(KSH) | 第24-28
页 |
| · 3-甾酮-9α-羟基化反应概况 | 第24-25
页 |
| · 3-甾酮-9α-羟基化酶的酶学分类 | 第25-27
页 |
| · 3-甾酮-9α-羟基化酶的抑制 | 第27-28
页 |
| · 分枝杆菌降解甾醇侧链的国内外相关研究现状及最新发展动态分析 | 第28-33
页 |
| · 分枝杆菌概况及在甾体代谢上的研究 | 第28-29
页 |
| · 国内外相关研究现状 | 第29-31
页 |
| · 菌种选育 | 第29-30
页 |
| · 培养基优化 | 第30
页 |
| · 发酵系统的研究 | 第30-31
页 |
| · 甾醇降解机制最新发展动态分析 | 第31-33
页 |
| · 构建甾醇降解基因工程菌的研究进展 | 第33
页 |
| · 本课题的研究目的与内容 | 第33-36
页 |
| · 课题背景 | 第33-35
页 |
| · 本课题的研究内容及目标 | 第35-36
页 |
| 第2章 新金分枝杆菌NwIB-01的筛选鉴定、生长特性研究 | 第36-50
页 |
| · 引言 | 第36
页 |
| · 材料与方法 | 第36-42
页 |
| · 实验材料 | 第36-38
页 |
| · 实验药品及仪器 | 第36-37
页 |
| · 菌株 | 第37
页 |
| · 培养基 | 第37-38
页 |
| · 实验方法 | 第38-42
页 |
| · 植物甾醇的乳化 | 第38
页 |
| · 微生物的富集、分离与纯培养 | 第38-39
页 |
| · 转化产物分析 | 第39
页 |
| · 菌种鉴定 | 第39-41
页 |
| · 菌种生长分析 | 第41-42
页 |
| · 结果与分析 | 第42-48
页 |
| · 微生物筛选鉴定 | 第42-46
页 |
| · 微生物的形态观察 | 第42-43
页 |
| · NwIB-01的植物甾醇转化实验 | 第43-44
页 |
| · 微生物的16SrDNA鉴定 | 第44-46
页 |
| · NwIB-01的生长特性及培养基选择 | 第46-48
页 |
| · 本章小结 | 第48-50
页 |
| 第3章 新金分枝杆菌NwIB-01中3-酮-4-烯类固醇化合物C_(1,2)位脱氢反应关键基因的克隆和酶学分析 | 第50-79
页 |
| · 引言 | 第50
页 |
| · 材料与方法 | 第50-66
页 |
| · 实验材料 | 第50-54
页 |
| · 菌株及质粒 | 第50-51
页 |
| · 培养基及试剂 | 第51-53
页 |
| · 实验药品及仪器 | 第53-54
页 |
| · 实验方法 | 第54-66
页 |
| · 菌种保藏 | 第55
页 |
| · 染色体DNA的制备 | 第55
页 |
| · 大肠杆菌质粒质粒DNA的提取 | 第55-56
页 |
| · DNA片段的凝胶电泳回收 | 第56
页 |
| · 小量PCR产物的纯化 | 第56
页 |
| · 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第56-57
页 |
| · T载体克隆 | 第57
页 |
| · 转化和筛选 | 第57
页 |
| · 阳性重组子的鉴定 | 第57-58
页 |
| · 引物设计 | 第58
页 |
| · 基因走读Genome-Walking及基因全长的获得 | 第58-60
页 |
| · 表达质粒的构建 | 第60-61
页 |
| · 蛋白质的原核表达及SDS-PAGE检测 | 第61-62
页 |
| · 重组菌诱导优化 | 第62-63
页 |
| · 大肠杆菌细胞破碎 | 第63
页 |
| · Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱分离纯化 | 第63
页 |
| · 透析 | 第63-64
页 |
| · 总蛋白含量测定 | 第64-65
页 |
| · 3-甾酮-△~1-脱氢酶酶活测定 | 第65
页 |
| · 基因工程大肠杆菌转化AD实验 | 第65
页 |
| · 基因序列的简单生物信息学分析 | 第65-66
页 |
| · 结果与分析 | 第66-77
页 |
| · NwIB-01中3-甾酮-△~1-脱氢酶基因保守序列的克隆 | 第66-68
页 |
| · 分枝杆菌基因组提取方法改进 | 第66-67
页 |
| · 分枝杆菌3-甾酮-△~1-脱氢酶保守序列的扩增 | 第67-68
页 |
| · NwIB-01中3-甾酮-△~1-脱氢酶基因全序列的克隆 | 第68-70
页 |
| · 构建pET-22b-ksdD_M和pET-32a-ksdD_M表达载体 | 第70-71
页 |
| · 3-甾酮-△~1-脱氢酶的优化表达 | 第71-74
页 |
| · 重组pET-22b-ksdD_M和pET-32a-ksdD_M的诱导表达 | 第71-72
页 |
| · 表达条件的优化 | 第72-73
页 |
| · 蛋白纯化 | 第73-74
页 |
| · 酶活测定 | 第74
页 |
| · 大肠杆菌全细胞转化实验 | 第74-75
页 |
| · 生物信息学分析 | 第75-77
页 |
| · 3-甾酮-△~1-脱氢酶的基因分析 | 第75-76
页 |
| · 3-甾酮-△~1-脱氢酶的跨膜结构分析 | 第76-77
页 |
| · 本章小结 | 第77-79
页 |
| 第4章 新金分枝杆菌NwIB-01中甾体9α-羟基化反应关键基因的克隆和酶学分析 | 第79-99
页 |
| · 引言 | 第79
页 |
| · 材料与方法 | 第79-84
页 |
| · 实验材料 | 第79-80
页 |
| · 实验方法 | 第80-84
页 |
| · 常规分子生物学实验方法 | 第80
页 |
| · 3-甾酮-9α-羟基化酶(KshA)的引物设计 | 第80-81
页 |
| · 3-甾酮-9α-羟基化酶(KshA)的保守序列的扩增 | 第81
页 |
| · 3-甾酮-9α-羟基化酶的染色体走读 | 第81
页 |
| · 3-甾酮-9α-羟基化酶全长基因的克隆 | 第81-82
页 |
| · 3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶(KshB)保守序列的扩增 | 第82
页 |
| · 3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶(KshB)全长序列的克隆 | 第82
页 |
| · 重组质粒的构建 | 第82
页 |
| · 重组pET32-ksh的诱导表达 | 第82-83
页 |
| · 表达产物鉴定 | 第83
页 |
| · 表达蛋白KshA的分离纯化 | 第83
页 |
| · 3-甾酮-9α-羟基化酶及其还原酶基因的共表达 | 第83-84
页 |
| · 结果与分析 | 第84-97
页 |
| · 3-甾酮-9α-羟基化酶基因保守序列的扩增 | 第84
页 |
| · 3-甾酮-9α-羟基化酶基因全长的克隆 | 第84-85
页 |
| · 3-甾酮-9α-羟基化酶序列及进化树分析 | 第85-90
页 |
| · 开放阅读框(ORF)的确定及蛋白一级结构分析 | 第85-87
页 |
| · KshA的二级结构及结构域预测 | 第87-89
页 |
| · 基因进化树及保守结构域分析 | 第89-90
页 |
| · 重组质粒的构建及转化 | 第90-91
页 |
| · KSH的诱导表达优化及蛋白纯化 | 第91-92
页 |
| · 全菌转化 | 第92
页 |
| · 3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶(KshB)基因的克隆 | 第92-93
页 |
| · 3-甾酮-9α-羟基化酶及其还原酶的共表达 | 第93-97
页 |
| · 本章小结 | 第97-99
页 |
| 第5章 新金分枝杆菌NwIB-01中3-甾酮-9α-羟基化酶(KshA)及3-甾酮-△~1-脱氢酶(KsdD)的基因敲除 | 第99-117
页 |
| · 引言 | 第99
页 |
| · 材料与方法 | 第99-107
页 |
| · 实验材料 | 第99-101
页 |
| · 菌株和质粒 | 第99-100
页 |
| · 实验试剂及器材 | 第100-101
页 |
| · 实验方法 | 第101-107
页 |
| · KsdD自杀敲除质粒的构建 | 第101-103
页 |
| · KsdD敲除工程菌阳性克隆子的筛选 | 第103-106
页 |
| · KSH自杀敲除质粒的构建 | 第106-107
页 |
| · KSH敲除工程菌阳性克隆子的筛选 | 第107
页 |
| · KsdD及KshA基因敲除工程菌的验证 | 第107
页 |
| · 实验结果 | 第107-116
页 |
| · KsdD上下游序列的扩增 | 第107-109
页 |
| · KsdD敲除质粒的构建 | 第109-110
页 |
| · KsdD基因敲除突变菌的筛选 | 第110-111
页 |
| · KsdD基因敲除突变菌的表型及生产特征鉴定 | 第111-113
页 |
| · KshA基因上下游序列的克隆及敲除质粒的构建 | 第113-116
页 |
| · 本章小结 | 第116-117
页 |
| 第6章 新金分枝杆菌NwIB-01中3-甾酮-△~1-脱氢酶(KsdD)的基因强化表达及基因工程菌ADD发酵试验初探 | 第117-127
页 |
| · 引言 | 第117
页 |
| · 材料与方法 | 第117-120
页 |
| · 实验材料 | 第117-118
页 |
| · 菌株和质粒 | 第117-118
页 |
| · 实验试剂及器材 | 第118
页 |
| · 实验方法 | 第118-120
页 |
| · KsdD穿梭表达质粒(pMV261-ksdDM)的构建 | 第118-119
页 |
| · KsdD整合表达质粒(pMV306-ksdDM)的构建 | 第119-120
页 |
| · 重组分枝杆菌的构建 | 第120
页 |
| · 重组分枝杆菌的稳定性分析 | 第120
页 |
| · 重组分枝杆菌NwIB-04的发酵初探 | 第120
页 |
| · 重组分枝杆菌NwIB-04的转化反应及产物分析 | 第120
页 |
| · 实验结果与分析 | 第120-125
页 |
| · 重组质粒pMV261-ksdD_M的构建 | 第120-121
页 |
| · 重组质粒pMV306-ksdD_M的构建 | 第121-122
页 |
| · 重组分枝杆菌重组子的鉴定 | 第122-123
页 |
| · 重组分枝杆菌的稳定性分析 | 第123
页 |
| · 重组分枝杆菌NwIB-04的性状检测及发酵放大实验 | 第123-125
页 |
| · 本章小结 | 第125-127
页 |
| 第7章 课题最新进展及结论与展望 | 第127-134
页 |
| · 课题最新进展-甾体降解基因簇的研究 | 第127-130
页 |
| · 结论 | 第130-132
页 |
| · 课题研究展望 | 第132-134
页 |
| 参考文献 | 第134-143
页 |
| 致谢 | 第143-144
页 |
| 博士期间发表的论文与专利 | 第144-145
页 |
| 附录一 缩写词和英汉对照 | 第145-146
页 |
| 附录二 NCBI提交序列信息 | 第146-151
页 |
