论文目录 | |
| 目录 | 第1-9
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| 摘要 氨基酰-tRNA 合成酶研究/戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的蛋白质工程 | 第9-13
页 |
| ABSTRACTThe study of aminoacyl-tRNA synthetase/Protein engineer ofglutaryl 7-amino-cephalosporin acid acylase | 第13-17
页 |
| 第一部分 氨基酰-tRNA 合成酶研究 | 第17-94
页 |
| 第一章 精氨酰-tRNA 合成酶研究 | 第17-42
页 |
| 第一节 不同的翻译起始产生两种人胞质精氨酰-tRNA 合成酶 | 第17-32
页 |
| 摘要 | 第17
页 |
| 关键词 | 第17-18
页 |
| 1 引言 | 第18-21
页 |
| 2 材料与方法 | 第21-24
页 |
| · 质粒菌株和细胞株 | 第21-22
页 |
| · 材料 | 第22
页 |
| · 定点诱变和质粒构建 | 第22-23
页 |
| · 蛋白质表达和纯化 | 第23-24
页 |
| · 细胞培养和转染 | 第24
页 |
| · Western印迹实验 | 第24
页 |
| 3 结果和讨论 | 第24-29
页 |
| · 人胞质ArgRS的表达和纯化 | 第25-26
页 |
| · 人细胞内也存在两种形式的胞质ArgRS | 第26-27
页 |
| · 不同的翻译起始产生了两种形式的人胞质ArgRS | 第27-29
页 |
| 参考文献 | 第29-32
页 |
| 第二节 刀豆氨酸对精氨酰-tRNA合成酶的抑制动力学研究 | 第32-42
页 |
| 摘要 | 第32
页 |
| 关键词 | 第32
页 |
| 1 引言 | 第32-33
页 |
| 2 材料和方法 | 第33-35
页 |
| · 材料 | 第33-34
页 |
| · 菌种和质粒 | 第34
页 |
| · 大肠杆菌tRNAArg的制备 | 第34
页 |
| · 蛋白质表达和纯化 | 第34-35
页 |
| · 刀豆氨酸抑制不同来源ArgRS的抑制动力学分析 | 第35
页 |
| 3 结果和讨论 | 第35-41
页 |
| · 大肠杆菌酿酒酵母和人胞质ArgRS的对精氨酸动力学常数的比较 | 第35-36
页 |
| · 刀豆氨酸对大肠杆菌酿酒酵母和人胞质ArgRS的抑制动力学 | 第36-39
页 |
| · 构建三级结构模型比较这三种ArgRS活性中心的结构差别 | 第39-41
页 |
| 参考文献 | 第41-42
页 |
| 第二章 超耐热菌Aquifexaeolicus亮氨酰-tRNA合成酶对亮氨酸tRNA的识别 | 第42-94
页 |
| 第一节 用酵母三杂交筛选研究超耐热菌Aquifexaeolicus亮氨酰-tRNA合成酶β-亚基的两个tRNA识别结构域 | 第42-69
页 |
| 摘要 | 第42
页 |
| 关键词 | 第42-43
页 |
| 1 引言 | 第43-45
页 |
| 2 材料和方法 | 第45-50
页 |
| · 材料 | 第45
页 |
| · 质粒和菌株 | 第45-46
页 |
| · 酵母三杂交系统的构建 | 第46-47
页 |
| · A.aeolicusαβ-LeuRS及其β-亚基的表达和纯化 | 第47-48
页 |
| · 凝胶阻滞方法分析A.aeolicusαβ-LeuRS及其β-亚基的tRNA结合能力 | 第48-49
页 |
| · 动力学分析 | 第49
页 |
| · 编校功能分析 | 第49-50
页 |
| 3 结果 | 第50-60
页 |
| · 在A.aeolicusαβ-LeuRS的β-subunit与它对应tRNALeu相互作用的基础上构建酵母三杂交系统 | 第50-52
页 |
| · 利用酵母三杂交系统筛选tRNA结合能力受损的β-亚基突变体 | 第52-53
页 |
| · 利用三杂交体系中分析构建的β-亚基的定点突变体与tRNALeu的结合 | 第53-55
页 |
| · β-亚基以及αβ-LeuRS的tRNA亲和力分析 | 第55-57
页 |
| · 动力学分析αβ-LeuRS突变体 | 第57-59
页 |
| · 突变Q269stop影响了酶的编校能力 | 第59-60
页 |
| 4 讨论 | 第60-64
页 |
| 参考文献 | 第64-69
页 |
| 第二节 Aquifexaeolicusαβ-LeuRS的β-亚基上的不变残基Pro77和Asn152参与tRNALeuD-茎环的识别 | 第69-83
页 |
| 摘要 | 第69
页 |
| 关键词 | 第69
页 |
| 1 引言 | 第69-71
页 |
| 2 材料和方法 | 第71-74
页 |
| · 材料 | 第71
页 |
| · 质粒和菌种 | 第71
页 |
| · RNA制备 | 第71-73
页 |
| · 蛋白质表达和纯化 | 第73
页 |
| · 凝胶阻滞分析 | 第73-74
页 |
| · 氨基酰化反应测定 | 第74
页 |
| 3 结果 | 第74-79
页 |
| · 保守残基P77的突变影响氨基酰化反应的过渡态而非基态 | 第74-77
页 |
| · 突变N152A和P77G均不影响酶催化氨基酰化小螺旋的能力 | 第77
页 |
| · αβ-LeuRSN152A和P77G变种酶催化一个由小螺旋D-茎环二者组成的底物tRNALeuACVL氨基酰化能力受损 | 第77-79
页 |
| 4 讨论 | 第79-80
页 |
| 参考文献 | 第80-83
页 |
| 第三节 用足迹实验研究超耐热菌AquifexaeolicustRNALeu被亮氨酰-tRNA合成酶的识别 | 第83-94
页 |
| 摘要 | 第83
页 |
| 关键词 | 第83
页 |
| 1 引言 | 第83-84
页 |
| 2 材料和方法 | 第84-87
页 |
| · 材料 | 第85
页 |
| · 含有硫代磷酸酯键的tRNA转录本的制备 | 第85
页 |
| · 氨基酰化反应测定 | 第85-86
页 |
| · P标记tRNA转录本 | 第86
页 |
| · 凝胶阻滞分析标记过的转录本与αβ-LeuRS的结合 | 第86
页 |
| · RNA足迹实验 | 第86-87
页 |
| 3 实验结果 | 第87-89
页 |
| · 硫代磷酸酯标记的tRNALeu制备及其质量 | 第87
页 |
| · tRNA与LeuRS结合 | 第87-88
页 |
| · RNA足迹实验发现αβ-LeuRS保护tRNA的D-茎和反密码茎 | 第88-89
页 |
| 4 讨论 | 第89-92
页 |
| 参考文献 | 第92-94
页 |
| 第二部分戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因在大肠杆菌中的分泌表达 | 第94-105
页 |
| 摘要 | 第94
页 |
| 关键词 | 第94
页 |
| 1 引言 | 第94-96
页 |
| 2 材料和方法 | 第96-99
页 |
| · 菌株和质粒 | 第96
页 |
| · 质粒pETCA1S和pSuperCA1S的构建 | 第96-98
页 |
| · 酶活力分析 | 第98
页 |
| · 工程菌的培养和菌体收集 | 第98-99
页 |
| · 细胞分级 | 第99
页 |
| · 优化培养条件 | 第99
页 |
| 3 实验结果 | 第99-103
页 |
| · 分泌表达质粒pETCA1S和pSuperCA1S的构建 | 第99-100
页 |
| · GL-7-ACA酰化酶在转化子中的高分泌表达 | 第100-101
页 |
| · 培养基温度和pH值对GL-7-ACA酰化酶 | 第101-102
页 |
| · 转化子的比活力 | 第102-103
页 |
| · 转化子的稳定性 | 第103
页 |
| 4 讨论 | 第103-105
页 |
| 参考文献 | 第105-107
页 |
| 结论 | 第107-109
页 |
| 在学期间发表论文 | 第109-111
页 |
| 致谢 | 第111-112
页 |
