论文目录 | |
中文摘要 | 第1-7
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Abstract | 第7-14
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第一章 引言 | 第14-37
页 |
1 α-半乳糖苷酶及其分子生物学的研究进展 | 第14-24
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· α-半乳糖苷酶的来源 | 第14
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· α-半乳糖苷酶的生理功能 | 第14-15
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· α-半乳糖苷酶的分类 | 第15-17
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· α-半乳糖苷酶的生化性质 | 第17-18
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· α-半乳糖苷酶的基因工程 | 第18-21
页 |
· α-半乳糖苷酶的表达与调控 | 第21-22
页 |
· α-半乳糖苷酶的结构和功能研究 | 第22-24
页 |
2 α-半乳糖苷酶的应用领域与应用前景 | 第24-27
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· 饲料工业 | 第24-26
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· 食品工业 | 第26
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· 造纸工业 | 第26-27
页 |
· 医疗领域 | 第27
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3 真核生物的表达系统 | 第27-36
页 |
· 啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统 | 第28
页 |
· 甲醇营养型酵母表达系统 | 第28-34
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· 多形汉逊酵母表达系统 | 第28-29
页 |
· 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第29-34
页 |
· 巴斯德毕赤酵母表达系统在在饲料添加剂开发上的应用 | 第34-36
页 |
· 饲料用酶 | 第34-35
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· 激素 | 第35
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· 抗菌肽 | 第35-36
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研究的目的和意义 | 第36-37
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第二章 一种来源于青霉的新的α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质 | 第37-53
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1 材料和方法 | 第37-42
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· 材料 | 第37
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· 菌株 | 第37
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· 试剂和仪器 | 第37
页 |
· 培养基和培养条件 | 第37
页 |
· 酶活性测定 | 第37
页 |
· 蛋白质浓度和分子量的测定 | 第37-38
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· 酶的分离纯化 | 第38
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· 离子交换层析 | 第38
页 |
· 凝胶过滤层析 | 第38
页 |
· 电泳 | 第38-40
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· SDS-PAGE | 第38-39
页 |
· 非变性PAGE | 第39
页 |
· 活性染色 | 第39-40
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· 非变性梯度凝胶电泳 | 第40
页 |
· α-半乳糖苷酶转PVDF膜 | 第40
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· 纯化蛋白的质谱鉴定与内肽序列的测定 | 第40
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· 酶学性质 | 第40-42
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· α-半乳糖苷酶的最适pH和pH稳定性的测定 | 第40-41
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· α-半乳糖苷酶的反应最适温度及热稳定性 | 第41
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· 不同金属离子及相关化学试剂对α-半乳糖苷酶的影响 | 第41
页 |
· α-半乳糖苷酶反应初速度和K_m及V_(max)的测定 | 第41
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· α-半乳糖苷酶比活性测定 | 第41-42
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· 底物特异性的测定 | 第42
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2 结果与分析 | 第42-52
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· 青霉F63α-半乳糖苷酶的活性染色 | 第42-43
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· 来源于青霉的α-半乳糖苷酶Agl1的纯化 | 第43-45
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· α-半乳糖苷酶的N端测序 | 第45
页 |
· 纯化蛋白的内肽序列的测定 | 第45-46
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· α-半乳糖苷酶的酶学性质 | 第46-52
页 |
· α-半乳糖苷酶活性的测定 | 第46
页 |
· α-半乳糖苷酶的酶学性质 | 第46-52
页 |
本章小结 | 第52-53
页 |
第三章 α-半乳糖苷酶基因的克隆 | 第53-70
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1 材料和方法 | 第53-59
页 |
· 材料 | 第53
页 |
· 菌株和质粒 | 第53
页 |
· 引物合成 | 第53
页 |
· 试剂盒、工具酶和生化试剂 | 第53
页 |
· 方法 | 第53-59
页 |
· 青霉F63基因组DNA的提取 | 第53-54
页 |
· α-半乳糖苷酶基因组DNA片段的扩增 | 第54
页 |
· 反向PCR | 第54-55
页 |
· α-半乳糖苷酶全长cDNA的获得 | 第55-56
页 |
· 双酶切 | 第56
页 |
· DNA电泳回收 | 第56-57
页 |
· 连接 | 第57
页 |
· 感受态细胞的制备 | 第57
页 |
· 电转化 | 第57-58
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· 筛选重组子 | 第58
页 |
· 质粒DNA的大量提取 | 第58-59
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· α-半乳糖苷酶DNA及cDNA序列测定、序列一致性比较 | 第59
页 |
2 结果 | 第59-69
页 |
· 获得α-半乳糖苷酶基因的部分序列 | 第59-60
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· 反向PCR | 第60-62
页 |
· α-半乳糖苷酶基因cDNA的克隆及鉴定 | 第62-64
页 |
· 青霉F63 α-半乳糖苷酶基因组DNA、cDNA及衍生的氨基酸序列分析 | 第64-65
页 |
· 青霉α-半乳糖苷酶起始密码子的推断 | 第65-66
页 |
· 青霉F63 α-半乳糖苷酶的序列一致性分析 | 第66-69
页 |
本章小结 | 第69-70
页 |
第四章 α-半乳糖苷酶基因的异源表达 | 第70-80
页 |
1 材料和方法 | 第70-74
页 |
· 材料 | 第70-71
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· 菌株与质粒 | 第70
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· 引物合成 | 第70
页 |
· 培养基 | 第70
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· 试剂及仪器 | 第70-71
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· 方法 | 第71-74
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· α-半乳糖苷酶的重组菌株的构建 | 第71
页 |
· α-半乳糖苷酶基因信号肽编码序列的去除 | 第71-72
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· 真核重组表达载体的构建 | 第72
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· 质粒DNA的处理 | 第72
页 |
· 酵母感受态的制备 | 第72-73
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· 酵母细胞的转化 | 第73
页 |
· 转化子的筛选 | 第73
页 |
· 目的基因在毕赤酵母中的表达检测 | 第73-74
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· 发酵罐水平重组酵母的高细胞密度发酵 | 第74
页 |
2 结果 | 第74-79
页 |
· 表达载体的构建和重组质粒的转化 | 第74-75
页 |
· 表达α-半乳糖苷酶的阳性重组子的筛选 | 第75-76
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· 摇瓶水平α-半乳糖苷酶的表达 | 第76
页 |
· 重组子的PCR检测 | 第76-77
页 |
· 发酵罐水平α-半乳糖苷酶的表达 | 第77-79
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本章小结 | 第79-80
页 |
第五章 重组与天然α-半乳糖酶的酶学性质比较 | 第80-92
页 |
1 材料和方法 | 第80-81
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· 试验材料 | 第80
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· 实验仪器 | 第80
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· 重组α-半乳糖酶的纯化 | 第80-81
页 |
· 粗酶液的制备 | 第80
页 |
· HiTrap Q Sepharose XL层析 | 第80
页 |
· Sephacryl S-200分子筛层析 | 第80-81
页 |
· 蛋白含量的测定 | 第81
页 |
· 电泳 | 第81
页 |
· 表达产物的脱糖基化 | 第81
页 |
· α-半乳糖酶的酶学性质的研究 | 第81
页 |
2 结果 | 第81-91
页 |
· 重组α-半乳糖苷酶的纯化 | 第81-84
页 |
· 天然和重组α-半乳糖苷酶的酶学性质比较 | 第84-91
页 |
· α-半乳糖苷酶的最适作用pH和pH稳定性 | 第84-85
页 |
· α-半乳糖苷酶的最适作用温度和热稳定性 | 第85-86
页 |
· 重组α-半乳糖苷酶的K_m值和最大反应速度V_(max) | 第86-87
页 |
· 不同化学试剂对天然和重组α-半乳糖苷酶酶活的影响 | 第87-88
页 |
· 天然和重组α-半乳糖苷酶的底物特异性 | 第88-90
页 |
· 重组α-半乳糖苷酶与天然α-半乳糖苷酶的酶学性质的比较 | 第90-91
页 |
本章小结 | 第91-92
页 |
第六章 讨论 | 第92-95
页 |
第七章 结论 | 第95-97
页 |
参考文献 | 第97-106
页 |
致谢 | 第106-107
页 |
作者简介 | 第107页 |