论文目录 | |
| 致谢 | 第1-10页 |
| 缩略词 | 第10-14页 |
| 摘要 | 第14-16页 |
| Abstract | 第16-17页 |
| 前言 | 第18-20页 |
| 1 文献综述 | 第20-40页 |
| 1.1 花粉内壁的发育 | 第21-24页 |
| 1.1.1 花粉发育 | 第21页 |
| 1.1.2 成熟花粉壁的结构 | 第21页 |
| 1.1.3 花粉壁发育过程 | 第21-22页 |
| 1.1.4 参与花粉内壁发育的基因 | 第22-24页 |
| 1.1.4.1 纤维素合成相关基因 | 第22页 |
| 1.1.4.2 果胶合成相关基因 | 第22-23页 |
| 1.1.4.3 果胶侧链修饰相关基因 | 第23页 |
| 1.1.4.4 花粉壁结构蛋白相关基因 | 第23页 |
| 1.1.4.5 其他基因 | 第23-24页 |
| 1.2 PME基因的研究进展 | 第24-28页 |
| 1.2.1 PME蛋白的结构 | 第24-25页 |
| 1.2.2 PME蛋白的性质 | 第25-26页 |
| 1.2.3 PME蛋白的作用模式 | 第26页 |
| 1.2.4 PME蛋白的抑制子 | 第26页 |
| 1.2.5 PME基因在植物生长发育中的功能 | 第26-28页 |
| 1.2.5.1 PME基因在营养生长过程中的功能 | 第27页 |
| 1.2.5.2 PME基因在生殖生长过程中的功能 | 第27-28页 |
| 1.3 CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物基因组编辑中的应用 | 第28-40页 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9系统简介 | 第29页 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物中的应用 | 第29-32页 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9体系被广泛用于植物基因组编辑 | 第32-37页 |
| 1.3.4 在植物中应用CRISPR/Cas9基因编辑技术的流程 | 第37-38页 |
| 1.3.5 CRISPR/Cas9基因编辑技术存在脱靶及其他问题 | 第38-39页 |
| 1.3.6 提高CRISPR/Cas9靶向效率的策略 | 第39页 |
| 1.3.7 获得不含T-DNA的突变体的方法 | 第39-40页 |
| 2 白菜等九种植物PME基因家族的鉴定及花发育相关PME的分析 | 第40-54页 |
| 2.1 材料与方法 | 第40-44页 |
| 2.1.1 植物材料和试剂耗材 | 第40页 |
| 2.1.2 植物基因组、基因表达数据及其他生物信息学工具 | 第40-41页 |
| 2.1.3 PME基因家族成员的鉴定 | 第41-43页 |
| 2.1.4 基因表达数据获取及处理 | 第43页 |
| 2.1.5 总RNA的提取及cDNA合成 | 第43页 |
| 2.1.6 白菜PME基因家族qRT-PCR分析 | 第43-44页 |
| 2.1.7 花发育相关PME启动子序列获取及分析 | 第44页 |
| 2.2 结果 | 第44-52页 |
| 2.2.1 白菜等九种植物的PME基因家族成员都较多 | 第44页 |
| 2.2.2 白菜等九种植物709个PME可分为五类 | 第44-46页 |
| 2.2.3 PME家族基因的表达分析 | 第46-49页 |
| 2.2.4 白菜PME基因表达验证 | 第49页 |
| 2.2.5 花序特异或优势表达的PME分析 | 第49-52页 |
| 2.3 讨论 | 第52-54页 |
| 2.3.1 在高等植物中PME基因家族成员都比较多 | 第52页 |
| 2.3.2 众多PME基因参与花序的发育 | 第52-53页 |
| 2.3.3 不同植物参与花序发育的PME在序列上高度保守 | 第53-54页 |
| 3 白菜和拟南芥花粉发育相关的四个PME基因序列与表达分析 | 第54-68页 |
| 3.1 材料与方法 | 第54-60页 |
| 3.1.1 植物材料、载体、菌种与主要试剂 | 第54-55页 |
| 3.1.2 DNA、RNA的提取与cDNA的合成 | 第55页 |
| 3.1.3 DNA和CDS的克隆 | 第55-56页 |
| 3.1.4 核酸和蛋白序列分析 | 第56页 |
| 3.1.5 实时荧光定量分析(qRT-PCR) | 第56页 |
| 3.1.6 启动子融合表达 | 第56-59页 |
| 3.1.6.1 载体构建及农杆菌转化 | 第56-59页 |
| 3.1.6.2 拟南芥浸花转化及转基因植株筛选 | 第59页 |
| 3.1.6.3 启动子融合表达载体转基因拟南芥的观察 | 第59页 |
| 3.1.7 亚细胞定位 | 第59-60页 |
| 3.1.7.1 亚细胞定位载体构建 | 第59页 |
| 3.1.7.2 洋葱表皮瞬时转化 | 第59-60页 |
| 3.1.7.3 亚细胞定位观察 | 第60页 |
| 3.2 结果 | 第60-65页 |
| 3.2.1 BcPME37a、BcPME37b、BcPME37c和AtPME37的启动子、核酸和蛋白质序列分析 | 第60-63页 |
| 3.2.2 BcPME37a、BcPME37b、BcPME37c和AtPME37在花粉中优势或特异表达 | 第63-64页 |
| 3.2.3 表明BcPME37c在花发育晚期表达量较高 | 第64页 |
| 3.2.4 BcPME37c的编码蛋白定位于细胞壁 | 第64-65页 |
| 3.3 讨论 | 第65-68页 |
| 3.3.1 BcPME37a、BcPME37b和AtPME37的功能可能相似 | 第65页 |
| 3.3.2 BcPME37c可能参与成熟花粉的发育和花粉萌发等过程 | 第65-66页 |
| 3.3.3 BcPME37a、BcPME37b和BcPME37c的功能可能有分化 | 第66-68页 |
| 4 白菜CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立 | 第68-88页 |
| 4.1 材料与方法 | 第68-74页 |
| 4.1.1 植物材料、载体、菌株、主要试剂及常用培养基配方 | 第68-69页 |
| 4.1.2 sgRNA的设计、合成及退火 | 第69页 |
| 4.1.3 CRISPR/Cas9载体的构建 | 第69-72页 |
| 4.1.4 sgRNA-Cas9-121载体对菜心的遗传转化 | 第72-73页 |
| 4.1.5 基因组DNA的提取 | 第73页 |
| 4.1.6 阳性芽及突变类型鉴定 | 第73-74页 |
| 4.1.7 T-DNA插入片段检测 | 第74页 |
| 4.1.8 脱靶检测 | 第74页 |
| 4.2 结果 | 第74-84页 |
| 4.2.1 克隆得到Bra003491、Bra007665和Bra014410基因DNA序列和CDS | 第74-77页 |
| 4.2.2 构建了单靶点载体并转化菜心得到突变体 | 第77-80页 |
| 4.2.3 构建了多靶点载体并转化菜心得到突变体 | 第80-82页 |
| 4.2.4 CRISPR/Cas9引起的白菜基因突变可以稳定地遗传到T_1代和T_2代 | 第82-83页 |
| 4.2.5 得到了不含T-DNA的Bra003491突变体 | 第83页 |
| 4.2.6 在白菜突变体中未检测到脱靶效应 | 第83-84页 |
| 4.3 讨论 | 第84-88页 |
| 4.3.1 高效菜心CRISPR/Cas9体系的建立 | 第84-85页 |
| 4.3.2 多靶点载体在菜心中实现大片段敲除 | 第85页 |
| 4.3.3 多靶点载体在菜心中实现两个基因的同时编辑 | 第85页 |
| 4.3.4 少数碱基的插入和缺失突变造成蛋白质移码突变或者翻译提早结束 | 第85-86页 |
| 4.3.5 T_0代的突变可以稳定遗传给后代 | 第86页 |
| 4.3.6 通过自交可以得到不含T-DNA的突变体 | 第86页 |
| 4.3.7 三条sgRNA在菜心中没有脱靶 | 第86-88页 |
| 5 BcPME37c在白菜花粉发育中的功能鉴定 | 第88-96页 |
| 5.1 材料与方法 | 第88-91页 |
| 5.1.1 植物材料和主要试剂耗材 | 第88页 |
| 5.1.2 敲除突变体的形态学观察 | 第88-89页 |
| 5.1.3 花粉活力检测 | 第89页 |
| 5.1.4 花粉直径测量 | 第89页 |
| 5.1.5 花粉苯胺蓝染色 | 第89页 |
| 5.1.6 花粉DAPI染色 | 第89页 |
| 5.1.7 花粉形态扫描电镜观察 | 第89页 |
| 5.1.8 花粉切片透射电镜观察 | 第89-90页 |
| 5.1.9 结籽率统计 | 第90-91页 |
| 5.2 结果 | 第91-94页 |
| 5.2.1 bcpme37c营养生长及四轮花器官的形态均正常 | 第91-92页 |
| 5.2.2 bcpme37c部分花粉吸胀后直径明显增大 | 第92页 |
| 5.2.3 BcPME37c突变后不影响花粉核的分裂及胼胝质的降解 | 第92页 |
| 5.2.4 bcpme37c部分花粉形态异常 | 第92-93页 |
| 5.2.5 bcpme37c成熟花粉内壁异常加厚 | 第93页 |
| 5.2.6 bcpme37c结籽正常 | 第93-94页 |
| 5.3 讨论 | 第94-96页 |
| 5.3.1 BcPME37c可能通过调控内壁HG的甲酯化程度来影响内壁的建构 | 第94-95页 |
| 5.3.2 bcpme37c表型不太明显可能是基因功能冗余导致 | 第95-96页 |
| 结论 | 第96-98页 |
| 参考文献 | 第98-110页 |
| 附录 | 第110-126页 |
| 附录1 附表和附图 | 第110-123页 |
| 附录2 常用试剂和培养基配方 | 第123-126页 |
| 在读期间发表的论文 | 第126页 |
