论文目录 | |
摘要 | 第1-6页 |
ABSTRACT | 第6-7页 |
主要符号表 | 第21-23页 |
1 绪论 | 第23-47页 |
1.1 淋巴瘤概述 | 第23-29页 |
1.1.1 淋巴瘤的分类 | 第23-24页 |
1.1.2 淋巴瘤的流行病学 | 第24页 |
1.1.3 淋巴瘤的病因 | 第24-27页 |
1.1.4 淋巴瘤的治疗现状 | 第27-29页 |
1.2 异硫氰酸酯类化合物 | 第29-32页 |
1.2.1 十字花科植物与异硫氰酸酯 | 第29-30页 |
1.2.2 异硫氰酸酯类化合物的药理作用 | 第30-31页 |
1.2.3 莱菔素和莱菔硫烷 | 第31-32页 |
1.3 细胞核转运蛋白CRM1及其抑制剂研究进展 | 第32-40页 |
1.3.1 CRM1结构与功能 | 第33-35页 |
1.3.2 CRM1过表达与肿瘤的关系 | 第35-37页 |
1.3.3 靶向CRM1抑制剂的研究现状 | 第37-40页 |
1.4 细胞凋亡和细胞自噬 | 第40-43页 |
1.4.1 细胞凋亡 | 第40-41页 |
1.4.2 细胞自噬 | 第41-43页 |
1.5 基于计算的理性药物设计 | 第43-44页 |
1.5.1 基于FIPsDock的分子对接 | 第43-44页 |
1.5.2 分子动力学模拟及自由能计算 | 第44页 |
1.6 本文主要研究思路及意义 | 第44-47页 |
2 LFS-01抑制淋巴瘤细胞增殖的机制研究 | 第47-66页 |
2.1 引言 | 第47页 |
2.2 实验材料及设备 | 第47-48页 |
2.2.1 细胞系 | 第47页 |
2.2.2 实验材料及主要试剂 | 第47-48页 |
2.2.3 实验设备 | 第48页 |
2.3 实验方法 | 第48-53页 |
2.3.1 细胞培养及稳转细胞株构建 | 第48-50页 |
2.3.2 细胞活性检测实验 | 第50页 |
2.3.3 CRM1货物蛋白的细胞核输出抑制实验 | 第50-51页 |
2.3.4 MALDI-TOF-MS检测LFS-01与NES结合位点的相互作用 | 第51页 |
2.3.5 流式细胞术检测细胞周期抑制 | 第51-52页 |
2.3.6 流式细胞术检测细胞凋亡 | 第52页 |
2.3.7 Western Blot检测 | 第52-53页 |
2.3.8 统计学分析 | 第53页 |
2.4 结果与讨论 | 第53-65页 |
2.4.1 LFS-01对淋巴瘤细胞及正常PBMC细胞增殖的抑制 | 第53-55页 |
2.4.2 LFS-01靶向CRM1抑制RanBP1和p53蛋白的细胞核输出 | 第55-57页 |
2.4.3 LFS-01和CRM1底物结合位点肽段的结合检测 | 第57-59页 |
2.4.4 LFS-01对CRM1突变细胞株的影响 | 第59-60页 |
2.4.5 LFS-01对CRM1蛋白表达量的影响 | 第60-61页 |
2.4.6 LFS-01对淋巴瘤细胞周期的影响 | 第61-62页 |
2.4.7 LFS-01诱导淋巴瘤细胞发生凋亡 | 第62-63页 |
2.4.8 LFS-01对caspase家族蛋白的影响 | 第63-65页 |
2.5 本章小结 | 第65-66页 |
3 LFS-01诱导淋巴瘤细胞发生线粒体自噬的机制研究 | 第66-87页 |
3.1 引言 | 第66页 |
3.2 实验材料及设备 | 第66页 |
3.3 实验方法 | 第66-70页 |
3.3.1 LFS-01对细胞形态的影响 | 第66页 |
3.3.2 LDH检测 | 第66-67页 |
3.3.3 透射电镜观察细胞自噬 | 第67页 |
3.3.4 激光共聚焦和Western blotting检测自噬蛋白LC-3Ⅱ的变化 | 第67页 |
3.3.5 线粒体和自噬小体的共定位检测 | 第67-68页 |
3.3.6 线粒体和溶酶体的共定位检测 | 第68页 |
3.3.7 细胞自噬对药物作用的影响 | 第68-69页 |
3.3.8 Nrf2细胞核定位检测及p62蛋白水平检测 | 第69页 |
3.3.9 AMPK和mTOR磷酸化水平检测 | 第69页 |
3.3.10 RNAseq数据分析 | 第69页 |
3.3.11 动物实验 | 第69-70页 |
3.3.12 统计学分析 | 第70页 |
3.4 结果与讨论 | 第70-86页 |
3.4.1 LFS-01对细胞形态的影响 | 第70-71页 |
3.4.2 LFS-01对细胞LDH释放水平影响 | 第71页 |
3.4.3 LFS-01诱导淋巴瘤细胞发生线粒体自噬 | 第71-73页 |
3.4.4 细胞自噬蛋白LC-3Ⅱ点状化分布及蛋白水平变化 | 第73-75页 |
3.4.5 线粒体和自噬小体的共定位检测 | 第75-76页 |
3.4.6 线粒体和溶酶体的共定位检测 | 第76-77页 |
3.4.7 细胞自噬促进淋巴瘤细胞死亡 | 第77-78页 |
3.4.8 LFS-01对淋巴瘤细胞株转录组的影响 | 第78-81页 |
3.4.9 LFS-01抑制Nrf2核输出进而增加p62蛋白表达 | 第81-82页 |
3.4.10 LFS-01可以激活细胞内AMPK-mTOR信号通路 | 第82-83页 |
3.4.11 抑制AMPK磷酸化能够抑制自噬发生 | 第83-84页 |
3.4.12 动物实验 | 第84-86页 |
3.5 本章小结 | 第86-87页 |
4 以LFS-01为先导化合物的CRM1抑制剂的设计和优化 | 第87-96页 |
4.1 引言 | 第87页 |
4.2 实验材料与方法 | 第87-90页 |
4.2.1 受体和配体小分子的准备及对接 | 第87页 |
4.2.2 基于片段的药物设计(FBDD) | 第87-88页 |
4.2.3 虚拟筛选 | 第88页 |
4.2.4 分子动力学模拟 | 第88-89页 |
4.2.5 MM-PBSA结合自由能计算 | 第89-90页 |
4.3 结果与讨论 | 第90-95页 |
4.3.1 CRM1抑制剂小分子库的构建 | 第90页 |
4.3.2 虚拟筛选得到LFS-25 | 第90-91页 |
4.3.3 能量分解比较LFS-01和LFS-25的差异 | 第91-95页 |
4.4 本章小结 | 第95-96页 |
5 LFS-25抑制大B细胞淋巴瘤增殖的机制研究 | 第96-115页 |
5.1 引言 | 第96页 |
5.2 实验材料及设备 | 第96-97页 |
5.3 实验方法 | 第97-100页 |
5.3.1 质粒的转化、扩增及提取 | 第97页 |
5.3.2 细胞培养及瞬转细胞株构建 | 第97-98页 |
5.3.3 细胞活性检测 | 第98页 |
5.3.4 CRM1货物蛋白的细胞核输出抑制实验 | 第98页 |
5.3.5 IκBα细胞核输出抑制 | 第98页 |
5.3.6 Western Blotting检测IκBα的磷酸化水平变化 | 第98页 |
5.3.7 IκBα和NF-κB的免疫共沉淀 | 第98-99页 |
5.3.8 双荧光素酶报告基因检测NF-κB转录活性 | 第99-100页 |
5.3.9 流式细胞术检测细胞周期抑制 | 第100页 |
5.3.10 流式细胞术检测细胞凋亡 | 第100页 |
5.3.11 Western Blotting检测凋亡通路蛋白变化 | 第100页 |
5.3.12 统计学分析 | 第100页 |
5.4 结果与讨论 | 第100-114页 |
5.4.1 质粒的核酸电泳检测 | 第100-101页 |
5.4.2 LFS-25对细胞生长的抑制 | 第101页 |
5.4.3 LFS-25抑制RanBP1和p53的细胞核输出 | 第101-104页 |
5.4.4 LFS-25抑制NES-GFP和Foxo1-GFP的蛋白核输出 | 第104-105页 |
5.4.5 LFS-25对CRM1的抑制依赖Cys528 | 第105-106页 |
5.4.6 IκBα细胞核输出抑制 | 第106-108页 |
5.4.7 Western Blotting检测IκBα的磷酸化水平变化 | 第108-109页 |
5.4.8 IκBα和NF-κB的免疫共沉淀 | 第109页 |
5.4.9 NF-κB磷酸化水平变化 | 第109-110页 |
5.4.10 荧光素酶报告基因检测NF-κB转录活性 | 第110-111页 |
5.4.11 流式细胞术检测细胞周期抑制 | 第111-113页 |
5.4.12 流式细胞术检测细胞凋亡 | 第113-114页 |
5.4.13 Western Blotting检测凋亡通路蛋白变化 | 第114页 |
5.5 本章小结 | 第114-115页 |
6 结论与展望 | 第115-117页 |
6.1 结论 | 第115页 |
6.2 创新点 | 第115-116页 |
6.3 展望 | 第116-117页 |
参考文献 | 第117-125页 |
附录A LFS-01对Raji和JeKo-1细胞转录组的影响 | 第125-127页 |
致谢 | 第127-128页 |
作者简介 | 第128页 |
攻读博士学位期间科研项目及科研成果 | 第128页 |