论文目录 | |
摘要 | 第10-12
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ABSTRACT | 第12-14
页 |
引言 | 第14-17
页 |
第一部分 文献综述 | 第17-47
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第一章 传染性法氏囊病病毒研究现状 | 第17-30
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1 IBDV发现历史 | 第17-18
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2 病毒学分类地位 | 第18
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3 基因组结构及编码蛋白功能 | 第18-23
页 |
· 5’-NCR和3’-NCR | 第18-20
页 |
· VP1蛋白 | 第20
页 |
· pVP2、VP2与4条多肽 | 第20-21
页 |
· VP3蛋白 | 第21-22
页 |
· VP4蛋白 | 第22-23
页 |
· VP5蛋白 | 第23
页 |
4 病毒复制及分子机制 | 第23-26
页 |
· IBDV的宿主细胞 | 第23-24
页 |
· 病毒复制的分子机制 | 第24-26
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5 IBDV致病机理与细胞凋亡 | 第26-28
页 |
6 抗原与毒力变异 | 第28
页 |
7 拯救技术在IBDV的研究中的应用 | 第28-29
页 |
8 小结 | 第29-30
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第二章 基因表达系列分析及相关技术研究进展 | 第30-47
页 |
1 SAGE技术的原理 | 第31-34
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2 SAGE文库构建方法的改进 | 第34
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3 SAGE标签的注释 | 第34-38
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· 注释策略 | 第34-36
页 |
· 未注释标签的进一步分析 | 第36-38
页 |
4 SAGE文库之间差异比较 | 第38
页 |
5 SAGE获得的表达差异基因的进一步实验分析 | 第38-39
页 |
· Northern杂交分析 | 第38-39
页 |
· 半定量RT-PCR和实时定量RT-PCR | 第39
页 |
· 基因芯片 | 第39
页 |
6.SAGE-like技术 | 第39-44
页 |
· 3’SAGE和5’SAGE | 第39
页 |
· CAGE | 第39-40
页 |
· GIS | 第40-41
页 |
· SAGE与ChiP联用 | 第41-42
页 |
· DK和MSDK | 第42-43
页 |
· DACS | 第43
页 |
· 其他 | 第43-44
页 |
7 SAGE及相关技术的应用 | 第44-46
页 |
· 转录组研究 | 第44-45
页 |
· 基因表达差异研究 | 第45-46
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· 发现新基因 | 第46
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8 结束语 | 第46-47
页 |
第二部分 研究内容 | 第47-135
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第一章 传染性法氏囊病病毒NB株基因组A节段全长CDNA克隆 | 第47-62
页 |
1 材料和方法 | 第48-50
页 |
· 载体、菌株、病毒株与SPF种蛋 | 第48
页 |
· 病毒的增殖、纯化与电镜观察 | 第48
页 |
· IBDV基因组dsRNA的提取 | 第48
页 |
· 引物设计和合成 | 第48-49
页 |
· Long accurate(LA)-PCR扩增基因组A节段全长cDNA | 第49
页 |
· IBDV基因组A节段全长cDNA的T-A克隆 | 第49-50
页 |
· 序列测定及分析 | 第50
页 |
2 结果 | 第50-58
页 |
· 病毒粒子观察与病毒基因组dsRNA提取 | 第50-52
页 |
· IBDV基因组A节段的克隆与鉴定 | 第52-53
页 |
· 序列测定结果 | 第53
页 |
· 序列分析 | 第53-58
页 |
3 讨论 | 第58-62
页 |
· 一步法LA-PCR克隆IBDV基因组A节段全长cDNA方法的建立 | 第58-59
页 |
· VP5蛋白 | 第59-60
页 |
· 多聚蛋白(VP2/4/3) | 第60
页 |
· 关于IBDV抗原变异和毒力变异的分子基础 | 第60-61
页 |
· 关于NB株与其它毒株的亲缘关系 | 第61-62
页 |
第二章 传染性法氏囊病毒感染前后VERO细胞基因表达差异分析 | 第62-84
页 |
1 材料和方法 | 第63-72
页 |
· 细胞培养与病毒感染 | 第63
页 |
· 细胞总RNA与mRNA分离 | 第63-64
页 |
· ds cDNA合成 | 第64-65
页 |
· NlaⅢ酶切双链cDNA | 第65
页 |
· Linker与结合在磁珠上的cDNA连接 | 第65-66
页 |
· MmeⅠ酶切获得cDNA标记物 | 第66
页 |
· 获得130-bp双标签 | 第66-68
页 |
· 双标签分离 | 第68-69
页 |
· 串联体产生 | 第69-70
页 |
· 串联子pZErO-1载体克隆 | 第70-71
页 |
· Screening of Clones | 第71
页 |
· 序列测定与LongSAGE数据分析 | 第71-72
页 |
2 结果 | 第72-81
页 |
· IBDV感染检测及细胞mRNA的分离 | 第72
页 |
· LongSAGE文库的构建及校验 | 第72-76
页 |
· 测序结果及数据分析 | 第76-81
页 |
3 讨论 | 第81-84
页 |
· 选用LongSAGE技术依据及其文库构建 | 第81-82
页 |
· 利用人类cDNA、UniGene数据注释标签 | 第82
页 |
· IBDV感染细胞基因表达谱特征 | 第82-84
页 |
第三章 传染性法氏囊病病毒A节段或VP2/4/3基因转化的VERO细胞基因表达差异分析 | 第84-108
页 |
1 材料和方法 | 第85-91
页 |
· 抗体与试剂 | 第85
页 |
· 真核表达载体构建 | 第85
页 |
· 细胞培养、质粒转染及单细胞克隆 | 第85-87
页 |
· 克隆化细胞的PCR和Southern blot鉴定 | 第87-89
页 |
· RT-PCR和Northern blot检测 | 第89
页 |
· A节段编码蛋白在克隆化细胞中的表达 | 第89-90
页 |
· DNA裂解分析和Caspase-3活性分析 | 第90
页 |
· Vero-A和Vero-VP2/4/3细胞LongSAGE文库构建 | 第90-91
页 |
· 文库标签提取与库间差异分析 | 第91
页 |
2 结果 | 第91-105
页 |
· 真核表达载体构建 | 第91
页 |
· G418阳性细胞筛选与克隆 | 第91-92
页 |
· 转入基因在克隆化细胞基因组中的整合分析 | 第92-93
页 |
· 转入基因在克隆化细胞中的转录分析 | 第93-94
页 |
· 转入基因表达产物在克隆化细胞中检测 | 第94-95
页 |
· DNA裂解分析和Caspase-3活性分析 | 第95-96
页 |
· Vero-A和Vero-VP2/4/3细胞LongSAGE文库构建 | 第96-97
页 |
· 测序结果及数据分析 | 第97-105
页 |
3 讨论 | 第105-108
页 |
· 细胞系的建立 | 第105
页 |
· VP2和VP5蛋白表达与细胞凋亡 | 第105-107
页 |
· A节段NCRs的功能 | 第107-108
页 |
第四章 表达传染性法氏囊病毒VP5蛋白的VERO细胞系建立及其转录本分析 | 第108-122
页 |
1 材料与方法 | 第108-110
页 |
· pCI-neo-VP5和pEGFP-VP5质粒构建 | 第108-109
页 |
· Vero细胞培养、质粒转染及克隆 | 第109
页 |
· 单克隆细胞株PCR和Southern blot鉴定 | 第109
页 |
· 单克隆细胞株RT-PCR和Northern blot鉴定 | 第109
页 |
· IPMA和IFA检测VP5蛋白表达 | 第109
页 |
· VP5蛋白表达免疫胶体金定位 | 第109-110
页 |
· Vero-VP5细胞LongSAGE文库构建 | 第110
页 |
· 文库标签提取与文库差异分析 | 第110
页 |
2.结果 | 第110-120
页 |
· VP5真核表达载体的构建 | 第110
页 |
· 克隆化细胞系的建立 | 第110-111
页 |
· VP5基因在克隆化细胞基因组中的整合分析 | 第111-112
页 |
· VP5基因在克隆化细胞中转录分析 | 第112
页 |
· VP5蛋白在Vero细胞中的表达 | 第112-114
页 |
· VP5蛋白在Vero细胞中的表达定位 | 第114-115
页 |
· Vero-VP5细胞LongSAGE文库的构建 | 第115-116
页 |
· 测序结果及初步数据分析 | 第116-120
页 |
3 讨论 | 第120-122
页 |
· 细胞系的建立 | 第120
页 |
· VP5蛋白功能 | 第120-122
页 |
第五章 表达传染性法氏囊病毒PVP2及其截短突变体蛋白的VERO细胞系的建立 | 第122-130
页 |
1 材料与方法 | 第123-124
页 |
· 构建IBDV VP2系列真核表达载体 | 第123
页 |
· Vero细胞培养及质粒转染和单细胞克隆 | 第123-124
页 |
· 单克隆细胞株PCR和Southern blot分析 | 第124
页 |
· RT-PCR和Northern blot检测 | 第124
页 |
· IPAM和IFA检测VP2蛋白表达 | 第124
页 |
2 结果 | 第124-127
页 |
· IBDV VP2系列重组质粒的构建 | 第124-125
页 |
· G418抗性细胞筛选与克隆 | 第125
页 |
· VP2基因在克隆化Vero细胞基因组中的整合分析 | 第125-126
页 |
· 克隆化细胞系中IBDV VP2基因mRNA转录检测 | 第126-127
页 |
· Vero细胞中VP2蛋白表达 | 第127
页 |
3 讨论 | 第127-130
页 |
第六章 表达传染性法氏囊病毒VP3蛋白的VERO细胞系的建立 | 第130-135
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1 材料和方法 | 第131
页 |
· pCI-neo-VP3真核表达载体的构建 | 第131
页 |
· Vero细胞培养及质粒的转染和单细胞克隆 | 第131
页 |
· 单克隆细胞株的PCR和Southern blot鉴定 | 第131
页 |
· RT-PCR和Northern blot检测单克隆细胞株的mRNA转录 | 第131
页 |
· IPMA检测VP3蛋白表达 | 第131
页 |
2 结果 | 第131-133
页 |
· 真核表达载体构建 | 第131-132
页 |
· 克隆化细胞系的建立 | 第132
页 |
· VP3基因在克隆化Vero细胞基因组中的整合分析与mRNA转录分析 | 第132-133
页 |
· VP3蛋白在Vero细胞中表达 | 第133
页 |
3 讨论 | 第133-135
页 |
全文总结 | 第135-136
页 |
附表 | 第136-152
页 |
参考文献 | 第152-167
页 |
第三部分 附录 | 第167-177
页 |
附录A 常用试剂及仪器 | 第167-169
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附录B 常用缓冲液及培养基配方 | 第169-176
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附录C 攻博期间发表或录用的学术论文 | 第176-177
页 |
致谢 | 第177
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