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传染性法氏囊病毒粒子感染及其A节段编码基因转化细胞的转录本初步分析

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传染性法氏囊病毒粒子感染及其A节段编码基因转化细胞的转录本初步分析
论文目录
 
摘要第10-12 页
ABSTRACT第12-14 页
引言第14-17 页
第一部分 文献综述第17-47 页
  第一章 传染性法氏囊病病毒研究现状第17-30 页
    1 IBDV发现历史第17-18 页
    2 病毒学分类地位第18 页
    3 基因组结构及编码蛋白功能第18-23 页
      · 5’-NCR和3’-NCR第18-20 页
      · VP1蛋白第20 页
      · pVP2、VP2与4条多肽第20-21 页
      · VP3蛋白第21-22 页
      · VP4蛋白第22-23 页
      · VP5蛋白第23 页
    4 病毒复制及分子机制第23-26 页
      · IBDV的宿主细胞第23-24 页
      · 病毒复制的分子机制第24-26 页
    5 IBDV致病机理与细胞凋亡第26-28 页
    6 抗原与毒力变异第28 页
    7 拯救技术在IBDV的研究中的应用第28-29 页
    8 小结第29-30 页
  第二章 基因表达系列分析及相关技术研究进展第30-47 页
    1 SAGE技术的原理第31-34 页
    2 SAGE文库构建方法的改进第34 页
    3 SAGE标签的注释第34-38 页
      · 注释策略第34-36 页
      · 未注释标签的进一步分析第36-38 页
    4 SAGE文库之间差异比较第38 页
    5 SAGE获得的表达差异基因的进一步实验分析第38-39 页
      · Northern杂交分析第38-39 页
      · 半定量RT-PCR和实时定量RT-PCR第39 页
      · 基因芯片第39 页
    6.SAGE-like技术第39-44 页
      · 3’SAGE和5’SAGE第39 页
      · CAGE第39-40 页
      · GIS第40-41 页
      · SAGE与ChiP联用第41-42 页
      · DK和MSDK第42-43 页
      · DACS第43 页
      · 其他第43-44 页
    7 SAGE及相关技术的应用第44-46 页
      · 转录组研究第44-45 页
      · 基因表达差异研究第45-46 页
      · 发现新基因第46 页
    8 结束语第46-47 页
第二部分 研究内容第47-135 页
  第一章 传染性法氏囊病病毒NB株基因组A节段全长CDNA克隆第47-62 页
    1 材料和方法第48-50 页
      · 载体、菌株、病毒株与SPF种蛋第48 页
      · 病毒的增殖、纯化与电镜观察第48 页
      · IBDV基因组dsRNA的提取第48 页
      · 引物设计和合成第48-49 页
      · Long accurate(LA)-PCR扩增基因组A节段全长cDNA第49 页
      · IBDV基因组A节段全长cDNA的T-A克隆第49-50 页
      · 序列测定及分析第50 页
    2 结果第50-58 页
      · 病毒粒子观察与病毒基因组dsRNA提取第50-52 页
      · IBDV基因组A节段的克隆与鉴定第52-53 页
      · 序列测定结果第53 页
      · 序列分析第53-58 页
    3 讨论第58-62 页
      · 一步法LA-PCR克隆IBDV基因组A节段全长cDNA方法的建立第58-59 页
      · VP5蛋白第59-60 页
      · 多聚蛋白(VP2/4/3)第60 页
      · 关于IBDV抗原变异和毒力变异的分子基础第60-61 页
      · 关于NB株与其它毒株的亲缘关系第61-62 页
  第二章 传染性法氏囊病毒感染前后VERO细胞基因表达差异分析第62-84 页
    1 材料和方法第63-72 页
      · 细胞培养与病毒感染第63 页
      · 细胞总RNA与mRNA分离第63-64 页
      · ds cDNA合成第64-65 页
      · NlaⅢ酶切双链cDNA第65 页
      · Linker与结合在磁珠上的cDNA连接第65-66 页
      · MmeⅠ酶切获得cDNA标记物第66 页
      · 获得130-bp双标签第66-68 页
      · 双标签分离第68-69 页
      · 串联体产生第69-70 页
      · 串联子pZErO-1载体克隆第70-71 页
      · Screening of Clones第71 页
      · 序列测定与LongSAGE数据分析第71-72 页
    2 结果第72-81 页
      · IBDV感染检测及细胞mRNA的分离第72 页
      · LongSAGE文库的构建及校验第72-76 页
      · 测序结果及数据分析第76-81 页
    3 讨论第81-84 页
      · 选用LongSAGE技术依据及其文库构建第81-82 页
      · 利用人类cDNA、UniGene数据注释标签第82 页
      · IBDV感染细胞基因表达谱特征第82-84 页
  第三章 传染性法氏囊病病毒A节段或VP2/4/3基因转化的VERO细胞基因表达差异分析第84-108 页
    1 材料和方法第85-91 页
      · 抗体与试剂第85 页
      · 真核表达载体构建第85 页
      · 细胞培养、质粒转染及单细胞克隆第85-87 页
      · 克隆化细胞的PCR和Southern blot鉴定第87-89 页
      · RT-PCR和Northern blot检测第89 页
      · A节段编码蛋白在克隆化细胞中的表达第89-90 页
      · DNA裂解分析和Caspase-3活性分析第90 页
      · Vero-A和Vero-VP2/4/3细胞LongSAGE文库构建第90-91 页
      · 文库标签提取与库间差异分析第91 页
    2 结果第91-105 页
      · 真核表达载体构建第91 页
      · G418阳性细胞筛选与克隆第91-92 页
      · 转入基因在克隆化细胞基因组中的整合分析第92-93 页
      · 转入基因在克隆化细胞中的转录分析第93-94 页
      · 转入基因表达产物在克隆化细胞中检测第94-95 页
      · DNA裂解分析和Caspase-3活性分析第95-96 页
      · Vero-A和Vero-VP2/4/3细胞LongSAGE文库构建第96-97 页
      · 测序结果及数据分析第97-105 页
    3 讨论第105-108 页
      · 细胞系的建立第105 页
      · VP2和VP5蛋白表达与细胞凋亡第105-107 页
      · A节段NCRs的功能第107-108 页
  第四章 表达传染性法氏囊病毒VP5蛋白的VERO细胞系建立及其转录本分析第108-122 页
    1 材料与方法第108-110 页
      · pCI-neo-VP5和pEGFP-VP5质粒构建第108-109 页
      · Vero细胞培养、质粒转染及克隆第109 页
      · 单克隆细胞株PCR和Southern blot鉴定第109 页
      · 单克隆细胞株RT-PCR和Northern blot鉴定第109 页
      · IPMA和IFA检测VP5蛋白表达第109 页
      · VP5蛋白表达免疫胶体金定位第109-110 页
      · Vero-VP5细胞LongSAGE文库构建第110 页
      · 文库标签提取与文库差异分析第110 页
    2.结果第110-120 页
      · VP5真核表达载体的构建第110 页
      · 克隆化细胞系的建立第110-111 页
      · VP5基因在克隆化细胞基因组中的整合分析第111-112 页
      · VP5基因在克隆化细胞中转录分析第112 页
      · VP5蛋白在Vero细胞中的表达第112-114 页
      · VP5蛋白在Vero细胞中的表达定位第114-115 页
      · Vero-VP5细胞LongSAGE文库的构建第115-116 页
      · 测序结果及初步数据分析第116-120 页
    3 讨论第120-122 页
      · 细胞系的建立第120 页
      · VP5蛋白功能第120-122 页
  第五章 表达传染性法氏囊病毒PVP2及其截短突变体蛋白的VERO细胞系的建立第122-130 页
    1 材料与方法第123-124 页
      · 构建IBDV VP2系列真核表达载体第123 页
      · Vero细胞培养及质粒转染和单细胞克隆第123-124 页
      · 单克隆细胞株PCR和Southern blot分析第124 页
      · RT-PCR和Northern blot检测第124 页
      · IPAM和IFA检测VP2蛋白表达第124 页
    2 结果第124-127 页
      · IBDV VP2系列重组质粒的构建第124-125 页
      · G418抗性细胞筛选与克隆第125 页
      · VP2基因在克隆化Vero细胞基因组中的整合分析第125-126 页
      · 克隆化细胞系中IBDV VP2基因mRNA转录检测第126-127 页
      · Vero细胞中VP2蛋白表达第127 页
    3 讨论第127-130 页
  第六章 表达传染性法氏囊病毒VP3蛋白的VERO细胞系的建立第130-135 页
    1 材料和方法第131 页
      · pCI-neo-VP3真核表达载体的构建第131 页
      · Vero细胞培养及质粒的转染和单细胞克隆第131 页
      · 单克隆细胞株的PCR和Southern blot鉴定第131 页
      · RT-PCR和Northern blot检测单克隆细胞株的mRNA转录第131 页
      · IPMA检测VP3蛋白表达第131 页
    2 结果第131-133 页
      · 真核表达载体构建第131-132 页
      · 克隆化细胞系的建立第132 页
      · VP3基因在克隆化Vero细胞基因组中的整合分析与mRNA转录分析第132-133 页
      · VP3蛋白在Vero细胞中表达第133 页
    3 讨论第133-135 页
全文总结第135-136 页
附表第136-152 页
参考文献第152-167 页
第三部分 附录第167-177 页
  附录A 常用试剂及仪器第167-169 页
  附录B 常用缓冲液及培养基配方第169-176 页
  附录C 攻博期间发表或录用的学术论文第176-177 页
致谢第177 页

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