论文目录 | |
| 目录 | 第1-11
页 |
| 摘要 | 第11-13
页 |
| Abstract | 第13-16
页 |
| 论文创新点 | 第16-17
页 |
| 前言 | 第17-19
页 |
| 第一部分 文献综述 | 第19-40
页 |
| 第一章 猪圆环病毒病 | 第19-32
页 |
| 1. PCVD的病原学特征 | 第19-25
页 |
| 1.1. PCV的发现 | 第19-20
页 |
| 1.2. PCV的形态学和理化特性 | 第20
页 |
| 1.3. PCV的分类地位 | 第20
页 |
| 1.4. PCV基因组与复制、转录 | 第20-22
页 |
| 1.5. PCV编码产物的功能 | 第22-25
页 |
| 1.5.1. Rep和Rep’蛋白 | 第22-23
页 |
| 1.5.2. Cap蛋白 | 第23-25
页 |
| 1.5.3. ORF3与其它ORF | 第25
页 |
| 2. PCVD的实验室诊断 | 第25-29
页 |
| 2.1. 病毒分离 | 第25-26
页 |
| 2.2. PCR | 第26-27
页 |
| 2.3. 原位杂交 | 第27-28
页 |
| 2.4. 免疫组化 | 第28
页 |
| 2.5. IFA/IPMA | 第28
页 |
| 2.6. ELISA | 第28-29
页 |
| 3. PCVD的疫苗研究 | 第29-32
页 |
| 3.1. PCV2诱导的免疫反应 | 第29-30
页 |
| 3.2. PCV2疫苗的研究 | 第30-32
页 |
| 第二章 病毒蛋白抗原表位分析与应用 | 第32-40
页 |
| 1. 抗原表位的种类 | 第32-33
页 |
| 2. 抗原表位分析方法 | 第33-38
页 |
| 2.1. B细胞抗原表位分析方法 | 第33-36
页 |
| 2.1.1. 传统化学"切割"法或酶法 | 第33
页 |
| 2.1.2. 生物物理方法 | 第33-34
页 |
| 2.1.3. 表位理论预测法 | 第34-35
页 |
| 2.1.4. 重叠多肽扫描技术 | 第35
页 |
| 2.1.5. 噬菌体表面展示肽库技术 | 第35-36
页 |
| 2.2. T细胞抗原表位分析方法 | 第36-38
页 |
| 2.2.1. 基于重叠多肽的T细胞表位分析 | 第36-37
页 |
| 2.2.2. T细胞表位理论预测 | 第37-38
页 |
| 3. 抗原表位分析与表位疫苗 | 第38-40
页 |
| 第二部分 研究内容 | 第40-117
页 |
| 第一章 猪圆环病毒衣壳蛋白的重组表达 | 第40-53
页 |
| 摘要 | 第40-41
页 |
| 1. 材料 | 第41
页 |
| 2. 方法 | 第41-46
页 |
| 2.1. pGEX-PCV2-dCap和pET-PCV1-dCap原核表达载体的构建 | 第41-42
页 |
| 2.2. PCV2 GST-dCap和PCV1 His-dCap融合蛋白的诱导表达 | 第42
页 |
| 2.3. SDS-PAGE与Western blot鉴定 | 第42-43
页 |
| 2.4. 表达条件优化 | 第43
页 |
| 2.5. 大量表达与纯化 | 第43-44
页 |
| 2.6. 蛋白含量测定 | 第44-46
页 |
| 3. 结果 | 第46-49
页 |
| 3.1. pGEX-PCV2-dCap和pET-PCV1-dCap原核表达载体的构建 | 第46
页 |
| 3.2. PCV重组Cap蛋白的表达与鉴定 | 第46-48
页 |
| 3.3. 表达条件优化与大量纯化 | 第48-49
页 |
| 4. 讨论 | 第49-53
页 |
| 第二章 猪圆环病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 | 第53-76
页 |
| 摘要 | 第53-54
页 |
| 1. 材料 | 第54
页 |
| 2. 方法 | 第54-58
页 |
| 2.1. PCV重组Cap抗原的制备 | 第54
页 |
| 2.2. PCV2病毒抗原的制备 | 第54
页 |
| 2.3. 动物免疫 | 第54
页 |
| 2.4. 杂交瘤细胞株的建立、筛选及腹水制备 | 第54-55
页 |
| 2.5. 间接ELISA | 第55
页 |
| 2.6. 间接免疫荧光试验(IFA) | 第55-56
页 |
| 2.7. 单抗效价与亚类鉴定 | 第56
页 |
| 2.8. 与PCV2重组GST-dCap、PCV1 His-dCap蛋白的反应性 | 第56
页 |
| 2.9. 与PCV2、PCV1感染细胞的反应性 | 第56
页 |
| 2.10. 与真核表达的PCV2 Cap蛋白和PCV1 Cap蛋白的反应性 | 第56-58
页 |
| 2.10.1. pCI-PCV2-Cap和pCI-PCV1-Cap真核表达载体的构建 | 第56-57
页 |
| · 转染级超纯真核表达质粒的提取 | 第57
页 |
| 2.10.3. 脂质体介导转染 | 第57-58
页 |
| 2.11. 单克隆抗体的中和活性测定 | 第58
页 |
| 3. 结果 | 第58-71
页 |
| 3.1. PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的制备和鉴定 | 第58-59
页 |
| 3.2. PCV1重组His-dCap蛋白单克隆抗体的制备和鉴定 | 第59
页 |
| 3.3. 单克隆抗体与PCV2、PCV1病毒的反应性 | 第59-65
页 |
| 3.4. 单克隆抗体与真核表达的PCV Cap蛋白的反应性 | 第65-70
页 |
| 3.5. 单克隆抗体的中和活性测定 | 第70-71
页 |
| 4. 讨论 | 第71-76
页 |
| 第三章 猪圆环病毒2型衣壳蛋白线性B细胞抗原表位的精细定位 | 第76-100
页 |
| 摘要 | 第76-77
页 |
| 1. 材料 | 第77
页 |
| 1.1. 试剂与仪器 | 第77
页 |
| 1.2. 单克隆抗体和多克隆抗体 | 第77
页 |
| 2. 方法 | 第77-83
页 |
| 2.1. 多肽的设计与合成 | 第77-81
页 |
| 2.2. 多肽溶解与保存 | 第81
页 |
| 2.3. 多肽偶联 | 第81-82
页 |
| 2.4. 试验设计 | 第82
页 |
| 2.5. Peptide-ELISA | 第82
页 |
| 2.6. Peptide-dot-ELISA | 第82
页 |
| 2.7. 多肽免疫实验 | 第82-83
页 |
| 2.8. PCV2血清学标志的初步评估 | 第83
页 |
| 3. 结果 | 第83-95
页 |
| 3.1. PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的抗原表位定位 | 第83
页 |
| · 位脯氨酸(~(233)Pro)是PCV2 Cap蛋白的特异、关键氨基酸 | 第83-84
页 |
| 3.3. PCV2 Cap蛋白的抗原表位谱 | 第84-85
页 |
| 3.4. 氨基酸位231-233、175-192、155-162、115-132是PCV2 Cap蛋白的免疫优势表位 | 第85-95
页 |
| 3.5. 表位231-233是PCV2 Cap蛋白潜在的血清学标志 | 第95
页 |
| 4. 讨论 | 第95-100
页 |
| 第四章 猪圆环病毒2型Cap蛋白抗体间接ELISA检测技术的建立 | 第100-117
页 |
| 摘要 | 第100-101
页 |
| 1. 材料 | 第101
页 |
| 1.1. 试剂与仪器 | 第101
页 |
| 1.2. 血清与实验动物 | 第101
页 |
| 2. 方法 | 第101-105
页 |
| 2.1. 抗原制备 | 第101
页 |
| 2.2. PCV2和PCV2 Cap猪阳性血清的制备 | 第101-102
页 |
| 2.3. IFA筛选临床血清 | 第102
页 |
| 2.4. ELISA操作基本程序 | 第102
页 |
| 2.5. ELISA反应体系的建立 | 第102-103
页 |
| 2.5.1. 抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定 | 第102
页 |
| 2.5.2. 酶标记抗体的工作浓度的确定 | 第102-103
页 |
| 2.5.3. 包被液的选择 | 第103
页 |
| 2.5.4. 封闭液的选择 | 第103
页 |
| 2.5.5. 样品稀释液的选择 | 第103
页 |
| 2.5.6. 血清最佳反应时间的确定 | 第103
页 |
| 2.5.7. 酶标抗体反应时间的确定 | 第103
页 |
| 2.5.8. TMB底物反应时间的确定 | 第103
页 |
| 2.6. 间接ELISA判定标准的确定 | 第103-104
页 |
| 2.7. 重复性检验 | 第104
页 |
| 2.7.1. 批内重复性试验 | 第104
页 |
| 2.7.2. 批间重复性试验 | 第104
页 |
| 2.8. 特异性试验 | 第104
页 |
| 2.9. 有效性试验 | 第104-105
页 |
| 2.9.1. 与IFA的比较 | 第104
页 |
| 2.9.2. 与PCV2全病毒ELISA的比较 | 第104-105
页 |
| 2.9.3. 与PCV2特异的Peptide ELISA的比较 | 第105
页 |
| 2.9.4. 与进口ELISA试剂盒的比较 | 第105
页 |
| 2.10. PCV2人工感染猪的抗体产生规律 | 第105
页 |
| 3. 结果 | 第105-113
页 |
| 3.1. 临床血清IFA检测结果 | 第105-106
页 |
| 3.2. 间接ELISA最佳工作条件的确定 | 第106-107
页 |
| 3.2.1. 抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定 | 第106
页 |
| 3.2.2. 酶标二抗的工作浓度和包被液的确定 | 第106-107
页 |
| 3.2.3. 封闭液与稀释液的确定 | 第107
页 |
| 3.2.4. 血清最佳反应时间与酶标抗体反应时间的确定 | 第107
页 |
| 3.2.5. TMB底物反应时间的确定 | 第107
页 |
| 3.3. ELISA判定标准 | 第107-109
页 |
| 3.4. 重复性 | 第109
页 |
| 3.5. ELISA方法的特异性 | 第109-110
页 |
| 3.6. 与IFA、PCV2全病毒ELISA的比较 | 第110-111
页 |
| 3.7. 与PCV2特异的Peptide ELISA和进口INGEZIM PCV2试剂盒的比较 | 第111-112
页 |
| 3.8. 人工感染PCV2病毒后的抗体变化 | 第112-113
页 |
| 4. 讨论 | 第113-117
页 |
| 全文总结 | 第117-118
页 |
| 参考文献 | 第118-126
页 |
| 常用缓冲液及培养基配方 | 第126-137
页 |
| 攻博期间发表或录用的学术论文 | 第137-138
页 |
| 致谢 | 第138
页 |
