论文目录 | |
| 致谢 | 第1-7
页 |
| 前言 | 第7-9
页 |
| 摘要 | 第9-11
页 |
| ABSTRACT | 第11-18
页 |
| 第1章 文献综述 | 第18-43
页 |
| · 鞘脂质研究进展 | 第18-31
页 |
| · 鞘脂质的结构 | 第18-19
页 |
| · 鞘脂质的生物合成途径及相关酶类 | 第19-24
页 |
| · 丝氨酸软脂酰转移酶(SPT) | 第19-20
页 |
| · 3-酮基二氢鞘氨醇还原酶(3KSR) | 第20
页 |
| · 二氢神经酰胺合成酶(DHCerS) | 第20-21
页 |
| · 二氢神经酰胺脱氢酶(DHCD) | 第21
页 |
| · 神经酰胺酶(CER) | 第21-22
页 |
| · 鞘氨醇激酶(SK) | 第22
页 |
| · 神经酰胺激酶(CK) | 第22
页 |
| · 神经酰胺转移蛋白(CERT) | 第22-23
页 |
| · 鞘磷脂合成酶(SMS) | 第23
页 |
| · 鞘磷脂酶(SM) | 第23
页 |
| · 鞘氨醇-1-磷酸裂解酶(SPL) | 第23-24
页 |
| · 鞘脂质在细胞反应中的作用 | 第24-31
页 |
| · 神经酰胺在细胞反应中的作用 | 第24-26
页 |
| · 神经鞘氨醇在细胞反应中的作用 | 第26-29
页 |
| · 磷酸鞘氨醇在细胞反应中的作用 | 第29-31
页 |
| · 神经酰胺酶研究进展 | 第31-38
页 |
| · 神经酰胺酶的生化特性 | 第31-34
页 |
| · 酸性神经酰胺酶(Acid ceramidase,AC) | 第31-32
页 |
| · 中性神经酰胺酶(Neutral ceramidase,NC) | 第32
页 |
| · 碱性神经酰胺酶(Alkaline ceramidase,ACER) | 第32-34
页 |
| · 神经酰胺酶在调节细胞反应中的作用 | 第34-38
页 |
| · 酸性神经酰胺酶 | 第34-36
页 |
| · 中性神经酰胺酶 | 第36-37
页 |
| · 碱性神经酰胺酶 | 第37-38
页 |
| · 果蝇鞘脂质代谢研究进展 | 第38-43
页 |
| · 果蝇作为鞘脂质代谢研究材料的优点 | 第38-41
页 |
| · 昆虫和果蝇的鞘脂质代谢 | 第41-43
页 |
| 第2章 果蝇BWA基因的克隆及表达 | 第43-57
页 |
| · 实验材料 | 第43-45
页 |
| · 果蝇品系 | 第43
页 |
| · 菌种、细胞系和真核表达系统 | 第43
页 |
| · 试剂 | 第43-44
页 |
| · 工具酶 | 第44
页 |
| · 仪器设备 | 第44
页 |
| · 试剂配制 | 第44-45
页 |
| · 实验方法 | 第45-50
页 |
| · 总RNA提取 | 第45-46
页 |
| · 甲醛变性电泳检测 | 第46
页 |
| · 总RNA浓度及纯度测定 | 第46
页 |
| · PCR引物设计 | 第46
页 |
| · cDNA第一链合成 | 第46-47
页 |
| · PCR扩增 | 第47
页 |
| · PCR产物纯化及克隆 | 第47
页 |
| · 感受态细胞制备(C_aCl_2法) | 第47-48
页 |
| · 连接转化 | 第48
页 |
| · 重组杆状病毒转移质粒pFastBacHT-BWA的构建 | 第48-49
页 |
| · 重组Bacmid的获得 | 第49
页 |
| · 昆虫细胞培养、转染及重组病毒的感染 | 第49
页 |
| · SDS-PAGE分析 | 第49
页 |
| · Western blot分析 | 第49-50
页 |
| · 结果与分析 | 第50-55
页 |
| · 总RNA提取 | 第50
页 |
| · BWA基因RT-PCR扩增及序列测定 | 第50-52
页 |
| · BWA基因序列分析 | 第52-53
页 |
| · 重组杆状病毒转移载体的构建 | 第53-54
页 |
| · 重组病毒Bacmid获得及重组Bacmid的转染、鉴定 | 第54-55
页 |
| · SDS-PAGEA及Western Blot分析 | 第55
页 |
| · 讨论 | 第55-57
页 |
| 第3章 BWA蛋白产物的神经酰胺酶活力测定 | 第57-67
页 |
| · 实验材料 | 第57-59
页 |
| · 真核表达系统 | 第57
页 |
| · 试剂及其他 | 第57
页 |
| · 试剂配制 | 第57-59
页 |
| · 仪器设备 | 第59
页 |
| · 实验方法 | 第59-61
页 |
| · Tn细胞microsomes提取 | 第59
页 |
| · BCA测定蛋白浓度 | 第59-60
页 |
| · 酶反应底物制备 | 第60
页 |
| · 酶反应 | 第60
页 |
| · 鞘脂质提取及HPLC分析 | 第60-61
页 |
| · 标准曲线绘制 | 第61
页 |
| · 回收率计算 | 第61
页 |
| · 结果与分析 | 第61-65
页 |
| · HPLC条件的建立 | 第61-62
页 |
| · BWA蛋白产物神经酰胺酶的活力测定 | 第62-63
页 |
| · BWA蛋白产物酶反应最适pH值测定 | 第63-65
页 |
| · 果蝇碱性神经酰胺酶最适底物的测定 | 第65
页 |
| · 讨论 | 第65-67
页 |
| 第4章 DaCER基因亚细胞定位及表达时相 | 第67-75
页 |
| · 实验材料 | 第67-68
页 |
| · 真核表达系统 | 第67
页 |
| · 果蝇 | 第67
页 |
| · 试剂 | 第67-68
页 |
| · 工具酶 | 第68
页 |
| · 仪器设备 | 第68
页 |
| · 实验方法 | 第68-70
页 |
| · 融合表达质粒pEGFP-C1-DaCER的构建 | 第68
页 |
| · DaCER在HeLa细胞中的亚细胞定位 | 第68-69
页 |
| · 总RNA提取 | 第69
页 |
| · 反转录合成cDNA第一链 | 第69
页 |
| · 引物设计 | 第69-70
页 |
| · Real time-PCR体系建立 | 第70
页 |
| · 数据分析 | 第70
页 |
| · 结果与分析 | 第70-73
页 |
| · pEGFP-C1-DaCER重组质粒构建 | 第70-71
页 |
| · 融合蛋白在HeLa细胞中的表达与定位 | 第71
页 |
| · DaCER基因在果蝇体内的表达时相 | 第71-73
页 |
| · 讨论 | 第73-75
页 |
| 第5章 DaCER对果蝇发育的影响 | 第75-79
页 |
| · 实验材料 | 第75-76
页 |
| · 果蝇 | 第75-76
页 |
| · 无菌Petri dish-90mm | 第76
页 |
| · 玉米粉培养基 | 第76
页 |
| · 实验方法 | 第76-77
页 |
| · 结果与分析 | 第77
页 |
| · 讨论 | 第77-79
页 |
| 第6章 DaCER对果蝇寿命和繁殖的影响 | 第79-84
页 |
| · 实验材料 | 第79
页 |
| · 实验方法 | 第79-80
页 |
| · 果蝇处理 | 第79-80
页 |
| · 数据处理 | 第80
页 |
| · 结果与分析 | 第80-82
页 |
| · 讨论 | 第82-84
页 |
| 第7章 DaCER影响果蝇发育、寿命和繁殖机理的研究 | 第84-97
页 |
| · 实验材料 | 第84-85
页 |
| · 果蝇 | 第84
页 |
| · 果蝇细胞 | 第84
页 |
| · 试剂 | 第84
页 |
| · 试剂配制 | 第84-85
页 |
| · 仪器设备 | 第85
页 |
| · 实验方法 | 第85-88
页 |
| · S2细胞复苏和冻存 | 第85-86
页 |
| · MAPP处理S2细胞 | 第86
页 |
| · MTT法测定细胞存活率 | 第86
页 |
| · HPLC分析MAPP处理的S2细胞的鞘脂质 | 第86
页 |
| · S2细胞中DaCER基因的RNA干扰 | 第86-87
页 |
| · DaCER基因下调后的S2细胞周期的分析 | 第87-88
页 |
| · 结果与分析 | 第88-95
页 |
| · MTT检测MAPP对细胞存活率的影响 | 第88
页 |
| · MAPP处理对S2细胞鞘氨醇代谢的影响 | 第88-90
页 |
| · DaCER失活对果蝇鞘脂质代谢的影响 | 第90-92
页 |
| · DaCER失活对S2细胞周期的影响 | 第92-95
页 |
| · 讨论 | 第95-97
页 |
| 第8章 总结与讨论 | 第97-101
页 |
| · 结论与讨论 | 第97-99
页 |
| · DaCER基因结构及蛋白功能的初步验证 | 第97
页 |
| · DaCER的定位及其对果蝇生理功能的影响 | 第97-98
页 |
| · DaCER影响果蝇生理功能机理的探究 | 第98-99
页 |
| · 本论文的创新之处 | 第99-100
页 |
| · 进一步研究方向 | 第100-101
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| 参考文献 | 第101-117
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