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大豆疫霉G蛋白α亚基调控游动孢子趋化性的机制研究

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大豆疫霉G蛋白α亚基调控游动孢子趋化性的机制研究
论文目录
 
摘要第1-12页
ABSTRACT第12-16页
引言第16-18页
上篇 文献综述第18-69页
  第一章 疫霉菌发育过程相关信号通路的研究进展第19-41页
    1 疫霉菌发育阶段的调控基因第19-23页
      · 孢子囊的形成与游动孢子的释放第19-20页
      · 游动孢子的游动与休止第20-21页
      · 休止孢的萌发第21-22页
      · 卵孢子的形成第22-23页
    2 调控疫霉菌发育的信号通路与信号因子第23-34页
      · 感知:GPCR/G蛋白信号通路第23-26页
      · 传递:蛋白激酶第26-29页
      · 调控:转录因子第29-34页
    参考文献第34-41页
  第二章 趋化物感应:趋化性第41-69页
    1 趋化性概述第41-42页
    2 原核生物的趋化性第42-48页
      · 趋化性的作用第42-43页
      · 趋化感应系统第43-45页
      · 趋化受体第45-47页
      · 其它趋化蛋白第47-48页
    3 真核模式生物的趋化性第48-54页
      · 概述第48-49页
      · 趋化物浓度梯度的产生第49-50页
      · GPCR/G蛋白信号通路参与调控趋化性过程第50-51页
      · GPCR/G蛋白信号通路的趋化反应模型第51-52页
      · GPCR调控的信号通路作用于肌动蛋白网络第52-54页
    4 植物病原卵菌的趋化性第54-59页
      · 游动孢子及萌发后芽管的趋化反应第54-55页
      · 部分趋化现象具有寄主特异性第55页
      · 丝囊霉类黄酮受体的检测第55-56页
      · G蛋白与GPCR-PIPK对趋化性的调控第56-59页
    参考文献第59-69页
下篇 研究内容第69-171页
  第一章 PsGPA1互作蛋白的筛选与鉴定第71-89页
    1 材料与方法第73-79页
      · 供试菌株第73-74页
      · 培养基及试剂配制第74页
      · 大豆疫霉菌株的培养及孢子囊阶段菌体的获得第74-75页
      · 载体构建第75-76页
      · 大豆疫霉总蛋白的提取第76-77页
      · Western blot鉴定目标蛋白第77页
      · 亲和纯化试验流程第77-78页
      · 质谱分析第78页
      · 候选蛋白功能域分析第78页
      · 重组蛋白的原核表达第78-79页
      · GST pull-down试验流程第79页
    2 结果与分析第79-85页
      · 融合了3×FLAG标签的PsGPA1表达菌株的获得第79-80页
      · 亲和纯化筛选PsGPA1互作蛋白第80-81页
      · 洗脱蛋白质谱鉴定结果分析第81-82页
      · 候选蛋白功能域分析第82-83页
      · GST pull-down验证候选蛋白与PsGPA1的互作关系第83-85页
    3 讨论第85-87页
    参考文献第87-89页
  第二章 PsPGA1的互作蛋白PsHint1参与调控大豆疫霉的趋化性及致病性第89-125页
    1 材料与方法第91-97页
      · 供试菌株第91-92页
      · 互作验证第92页
      · 生物信息学分析第92页
      · 大豆疫霉DNA、RNA提取及cDNA的制备第92-93页
      · 载体构建第93-95页
      · 大豆疫霉原生质体转化第95页
      · SYBR Green实时定量PCR验证第95页
      · PsHint1沉默转化子各发育阶段表型观测第95-97页
      · PsHint1沉默转化子致病性分析第97页
    2 结果与分析第97-117页
      · PsHint1与PsGPA1互作验证第97-101页
      · PsHint1蛋白多重序列比对和系统发育分析第101-105页
      · PsHint1在侵染阶段上调表达第105页
      · PsHint1在大豆疫霉中的亚细胞定位第105-106页
      · PsHint1沉默转化子的获得第106-108页
      · PsHint1的基因沉默影响了游动孢子趋化性第108-111页
      · PsHint1的沉默导致休止孢萌发异常第111-113页
      · PsHint1参与调控大豆疫霉致病过程第113-117页
    3 讨论第117-121页
    参考文献第121-125页
  第三章 致病相关蛋白PsHint1参与调控的下游信号通路分析第125-155页
    1 材料与方法第128-132页
      · 供试菌株第128页
      · 培养基配制第128页
      · 融合FLAG标签的PsHint1表达载体的构建第128-129页
      · 大豆疫霉菌株的培养及无性发育各阶段菌体的获得第129页
      · 大豆疫霉对氧化压力胁迫环境的耐受性测定第129-130页
      · 大豆黄化苗下胚轴表皮细胞活性氧积累的细胞学观察第130页
      · DPI处理抑制寄主活性氧积累实验第130页
      · 大豆疫霉不同侵染时间点的RNA提取及cDNA的制备第130-131页
      · SYBR Green实时定量PCR分析第131-132页
      · 数据相关性分析第132页
      · 亲和纯化筛选互作蛋白第132页
    2 结果与分析第132-146页
      · PsHint1沉默突变体侵染点周围活性氧大量积累第132-133页
      · PsHint1的沉默影响大豆疫霉对H_2O_2的耐受性第133-134页
      · 对ROS的抑制可以部分恢复PsHint1沉默转化子的致病力第134-137页
      · PsHint1的沉默影响了RxLR效应分子的正常转录模式第137-139页
      · PsHint1沉默转化子侵染阶段RNA-Seq结果分析第139-143页
      · 亲和纯化筛选PsHint1互作蛋白第143-145页
      · 洗脱蛋白质谱鉴定第145-146页
    3 讨论第146-150页
    参考文献第150-155页
  第四章 PsGPA1靶标蛋白的筛选及功能分析第155-171页
    1 材料与方法第157-160页
      · 供试菌株第157页
      · 培养基及试剂配制第157页
      · 大豆疫霉菌株的培养及孢子囊阶段菌体的获得第157-158页
      · 载体构建第158页
      · 大豆疫霉总蛋白的提取第158-159页
      · 亲和纯化试验流程第159页
      · 质谱分析第159页
      · 候选蛋白功能域分析第159-160页
      · 重组蛋白的原核表达第160页
      · GST pull-down试验流程第160页
      · SYBR Green实时定量PCR验证第160页
    2 结果与分析第160-167页
      · 亲和纯化筛选PsGPA1靶标蛋白第160-161页
      · 洗脱蛋白质谱鉴定结果分析第161-162页
      · 候选蛋白功能域分析第162-163页
      · 候选基因均在侵染阶段上调表达第163-164页
      · 部分候选蛋白在孢子囊或侵染阶段被磷酸化第164-165页
      · GST pull-down验证候选蛋白与PsGPA1的互作关系第165-167页
    3 讨论第167-169页
    参考文献第169-171页
附录一 疫霉菌蛋白共表达体系的建立第171-185页
  1 材料与方法第173-176页
    · Golden Gate操作步骤第173-174页
    · In Fusion操作步骤第174页
    · co-IP载体的构建第174-175页
    · 供试菌株第175-176页
    · 大豆疫霉原生质体转化第176页
  2 结果与分析第176-182页
    · 基于pTOR-mRFP的共表达载体改造第176-178页
    · 用于Golden Gate的一级载体改造第178-179页
    · 用于Golden Gate的元件设计第179-181页
    · 疫霉蛋白共表达体系的应用第181-182页
  3 讨论第182-183页
  参考文献第183-185页
附录二 CRISPR-Cas9技术在疫霉菌中的应用探索第185-201页
  1 材料与方法第187-190页
    · 载体的构建第187-189页
    · Golden Gate操作步骤第189页
    · 供试菌株第189页
    · 大豆疫霉原生质体转化第189页
    · 大豆疫霉菌丝细胞核的染色第189-190页
    · 转化子的验证第190页
  2 结果与分析第190-195页
    · 目标基因及靶标序列确定第190-191页
    · 核定位信号预测及试验验证第191-192页
    · Cas9及sgRNA共表达载体的构建第192-193页
    · 转化子筛选第193-194页
    · Nmcas9的使用第194-195页
  3 讨论第195-197页
  参考文献第197-201页
全文总结及创新点第201-203页
攻读博士学位期间发表的研究论文第203-205页
致谢第205页

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