论文目录 | |
中文摘要 | 第1-9
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Abstract | 第9-13
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前言 | 第13-30
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一、氧化性低密度脂蛋白与动脉粥样硬化密切相关 | 第13-21
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1、Ox-LDL的生成机制及影响因素 | 第13-16
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2、OxLDL在巨噬细胞中的代谢 | 第16-19
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·、OxLDL的摄取和降解 | 第16-17
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·、Ox-LDL对巨噬细胞功能的影响 | 第17-19
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· 诱导巨噬细胞的黏附、趋化和分化 | 第17-18
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· 对泡沫细胞形成的影响 | 第18
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·、对巨噬细胞增殖的调控 | 第18-19
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·、Ox-LDL诱导巨噬细胞的凋亡 | 第19
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3、OxLDL与血管内皮细胞损伤 | 第19-20
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4、OxLDL促进血管平滑肌细胞的增殖与迁移 | 第20
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5、OxLDL对细胞生长因子、组织因子及前列腺素类物质代谢的影响 | 第20-21
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二、核因子κB信号转导途径与动脉粥样硬化 | 第21-24
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1、NF-κB是调控基因转录的重要因子 | 第21-22
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2、动脉粥样硬化灶中存在活化的 | 第22-23
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3、NF-κB调控动脉粥样硬化 | 第23-24
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·、NF-κB与炎性分子 | 第23
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·、NF-κB与单核细胞的募集 | 第23-24
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·、NF-κB与血管平滑肌细胞的迁移和增生 | 第24
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三、锌指蛋白A20 | 第24-28
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1、A20的理化特性和分子生物学特性 | 第24-25
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2、A20对机体炎症反应的调控作用 | 第25-26
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3、A20调控炎症的分子机制 | 第26-28
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四、本研究的主要内容 | 第28-30
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材料与方法 | 第30-47
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一、实验材料 | 第30-31
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1、菌株与质粒 | 第30
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2、实验用大鼠与放射性核素 | 第30
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3、限制性内切酶及修饰酶 | 第30
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4、试剂盒 | 第30
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5、实验用抗体 | 第30-31
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6、其它主要试剂和材料 | 第31
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7、主要仪器设备 | 第31
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二、实验方法 | 第31-47
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1、感受态大肠杆菌DH5-α制备 | 第31-32
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2、质粒的转化和扩增 | 第32
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3、质粒提取和纯化 | 第32-33
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4、质粒的鉴定 | 第33
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5、重组腺病毒的制备和检测 | 第33-35
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·、重组腺病毒毒株 | 第33
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·、重组腺病毒的制备 | 第33-35
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·、备用细胞的储备 | 第33
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·、建立备用病毒 | 第33-34
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·、重组腺病毒Ad-GFP和Ad-A20的生产 | 第34
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·、病毒纯化 | 第34-35
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·、重组腺病毒质量检测 | 第35
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6、AdA20转染RAW264.7细胞与VSMC后A20基因表达持续时间检测 | 第35
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7、细胞培养 | 第35-36
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·、细胞传代的操作方法 | 第36
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·、细胞冻存的操作方法 | 第36
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·、细胞复苏的操作方法 | 第36
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8、正常大鼠主动脉平滑肌细胞培养 | 第36-38
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·、VSMC原代培养 | 第36-37
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·、VSMC传代培养 | 第37
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·、VSMC的冻存与复苏 | 第37-38
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·、VSMC冻存 | 第37
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·、肌细胞鉴定 | 第37-38
页 |
9、MTT分析 | 第38
页 |
10、~3H-TdR | 第38
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11、VSMC迁移能力变化的检测 | 第38-39
页 |
12、流式细胞仪检测细胞周期 | 第39
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13、细胞凋亡的检测 | 第39-40
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·、Hochest 33258染色 | 第39-40
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·、流式细胞术分析 | 第40
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·、DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第40
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14、线粒体膜电位分析 | 第40
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15、线粒体提取 | 第40-41
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16、Western-blotting印迹 | 第41-44
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·、细胞裂解 | 第41
页 |
·、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第41-43
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·、灌制分离胶: | 第41-42
页 |
·、灌制浓缩(堆积)胶: | 第42
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·、制备样品和上样: | 第42
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·、电泳: | 第42-43
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·、染色: | 第43
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·、免疫印迹 | 第43-44
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17、电泳迁移实验EMSA | 第44-45
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·、核蛋白的提取 | 第44
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·、探针的标记与纯化 | 第44
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·、探针的纯化 | 第44-45
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·、测定探针的放射活性 | 第45
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·、凝胶迁移阻滞法测定NF-κB | 第45
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18、报告基因转录活性的检测 | 第45-46
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19、细胞的泡沫化实验 | 第46-47
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实验结果 | 第47-74
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一、A20对RAW264.7细胞的作用 | 第47-66
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1、A20基因穿梭质粒载体的构建 | 第47-48
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2、A20基因重组腺病毒的产生 | 第48
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3、Ad-A20的扩增与滴度测定 | 第48-49
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·、Ad-A20的扩增: | 第48-49
页 |
·、Ad-A20收集、纯化: | 第49
页 |
·、倍比稀释法测定: | 第49
页 |
4、A20对OxLDL诱导的NF-κB信号传导通路的影响 | 第49-51
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5、A20对OxLDL介导的RAW264.7细胞毒性作用的影响 | 第51-52
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·、细胞形态的观察 | 第51
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·、MTT分析 | 第51-52
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6、A20对OxLDL介导的RAW264.7巨噬细胞凋亡的影响 | 第52-55
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·、Hochest 33258染色 | 第52-53
页 |
·、细胞DNA含量分析 | 第53
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·、DNA ladder分析 | 第53-55
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7、A20对OxLDL介导的细胞周期及相关周期蛋白的作用 | 第55-56
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8、A20对OxLDL介导的RAW264.7细胞Caspase激活的影响 | 第56-59
页 |
9、A20对OxLDL介导的RAW264.7细胞线粒体凋亡通路的影响 | 第59-62
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10、A20对OxLDL介导的RAW264.7细胞Fas/FasL凋亡通路的影响 | 第62-63
页 |
11、A20对OxLDL介导的MCP-1表达的影响 | 第63-64
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12、A20对OxLDL诱导的MMPs表达的影响 | 第64-65
页 |
13、A20对OxLDL介导的RAW264.7细胞泡沫化的影响 | 第65-66
页 |
二、A20对VSMC的作用 | 第66-74
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1、大鼠VSMC的培养及鉴定 | 第66
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·、细胞的生长特征 | 第66
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·、培养细胞的纯化和鉴定 | 第66
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2、A20对OxLDL诱导的NF-κB信号传导通路的影响 | 第66-68
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3、A20对VSMC增殖的影响 | 第68-69
页 |
·、MTT分析 | 第68-69
页 |
·、DNA合成分析 | 第69
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4、A20对OxLDL诱导的VSMC迁移的影响 | 第69-70
页 |
5、A20对OxLDL介导的细胞周期以及细胞周期相关蛋白的影响 | 第70-72
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6、A20对OxLDL诱导的MMP-2、MMP-9以及MCP-1的影响 | 第72-74
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讨论 | 第74-90
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一、A20抑制OxLDL介导的RAW264.7巨噬细胞的细胞毒性 | 第74-75
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二、A20通过不同机制抑制OxLDL所诱导的RAW264.7细胞的凋亡 | 第75-82
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1、A20的表达抑制OxLDL介导的NF-κB的激活而抑制细胞凋亡发生 | 第75-76
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2、A20通过改变细胞周期而抑制OxLDL所诱导的细胞的凋亡 | 第76-77
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3、A20通过阻断Caspase活化的外源性途径而抑制OxLDL所诱导的细胞的凋亡 | 第77-79
页 |
4、A20通过阻断线粒体通路而抑制OxLDL所诱导的细胞的凋亡 | 第79-80
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5、A20通过阻断Fas/FasL通路而抑制OxLDL所诱导的细胞的凋亡 | 第80-82
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三、A20的表达抑制MMP-2、MMP-9在OxLDL激活的巨噬细胞中的水平 | 第82-83
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四、A20的表达抑制MCP-1的表达与转录而逆转巨噬细胞泡沫化 | 第83-84
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五、A20抑制VSMC增殖与迁移 | 第84-90
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1、A20的表达抑制VSMC增殖与迁移 | 第84-85
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2、A20抑制OxLDL介导的VSMC NF-κB信号 | 第85-86
页 |
3、A20通过调节细胞周期蛋白的表达而影响细胞周期抑制OxLDL介导的VSMC增殖 | 第86-87
页 |
4、A20通过抑制OxLDL介导的MMP-2、MMP-9、MCP-1的表达而抑制VSMC迁移 | 第87-90
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小结 | 第90-91
页 |
参考文献 | 第91-103
页 |
文献综述 | 第103-117
页 |
英文名词及缩写 | 第117-119
页 |
致谢 | 第119-120
页 |
个人简历 | 第120页 |