论文目录 | |
| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-28页 |
| 1.1 新城疫概述 | 第15页 |
| 1.1.1 新城疫的发现 | 第15页 |
| 1.1.2 临床症状 | 第15页 |
| 1.2 新城疫病毒概述 | 第15-18页 |
| 1.2.1 新城疫病毒分类 | 第15-16页 |
| 1.2.2 新城疫病毒毒力测定 | 第16页 |
| 1.2.3 新城疫病毒病原学特征 | 第16-17页 |
| 1.2.4 新城疫病毒复制 | 第17-18页 |
| 1.3 新城疫病毒诱导家禽的天然免疫反应 | 第18-22页 |
| 1.3.1 JAK-STAT信号通路概述 | 第19-21页 |
| 1.3.2 NDV逃逸宿主天然免疫 | 第21-22页 |
| 1.4 转录组测序技术及其应用 | 第22-24页 |
| 1.5 SOCS蛋白家族研究进展 | 第24-27页 |
| 1.5.1 SOCS蛋白结构 | 第25页 |
| 1.5.2 SOCS蛋白功能 | 第25-27页 |
| 1.6 本研究的目的与意义 | 第27-28页 |
| 第二章 NDV感染鸡体后法氏囊组织的转录组测序与分析 | 第28-51页 |
| 2.1 材料 | 第28页 |
| 2.1.1 动物、细胞和毒株 | 第28页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第28页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第28页 |
| 2.1.4 常规试剂配制 | 第28页 |
| 2.2 试验方法 | 第28-34页 |
| 2.2.1 病毒增殖 | 第28-29页 |
| 2.2.2 噬斑试验 | 第29页 |
| 2.2.3 标准曲线的制备 | 第29-31页 |
| 2.2.3.1 引物设计 | 第29页 |
| 2.2.3.2 病毒RNA的提取 | 第29页 |
| 2.2.3.3 反转录 | 第29-30页 |
| 2.2.3.4 F_48E_9 P基因的扩增 | 第30页 |
| 2.2.3.5 重组质粒的构建 | 第30-31页 |
| 2.2.3.6 重组质粒拷贝数的计算 | 第31页 |
| 2.2.3.7 标准曲线的建立 | 第31页 |
| 2.2.4 动物攻毒试验 | 第31页 |
| 2.2.5 苏木精-伊红染色(HE) | 第31页 |
| 2.2.6 转录组测序 | 第31-33页 |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR | 第33-34页 |
| 2.2.8 数据统计 | 第34页 |
| 2.3 结果 | 第34-48页 |
| 2.3.1 NDV感染鸡体后的临床病理变化 | 第34-37页 |
| 2.3.1.1 针对NDV P基因的标准曲线建立 | 第34-35页 |
| 2.3.1.2 NDV感染后的临床得分指数和存活率 | 第35页 |
| 2.3.1.3 法氏囊的病理变化 | 第35-36页 |
| 2.3.1.4 NDV诱导法氏囊产生的免疫反应 | 第36-37页 |
| 2.3.2 测序质量评估 | 第37-39页 |
| 2.3.2.1 法氏囊总RNA质量检测 | 第37页 |
| 2.3.2.2 参考序列比对分析 | 第37-38页 |
| 2.3.2.3 RNA-Seq相关性分析 | 第38-39页 |
| 2.3.3 差异表达基因分析 | 第39-45页 |
| 2.3.3.1 差异表达基因数量统计 | 第39-40页 |
| 2.3.3.2 差异表达基因GO富集 | 第40-43页 |
| 2.3.3.3 差异表达基因信号通路分析 | 第43-45页 |
| 2.3.4 转录组数据验证 | 第45-46页 |
| 2.3.5 48h和72h共表达DEGs分析 | 第46-48页 |
| 2.3.5.1 蛋白互作网络分析 | 第46-47页 |
| 2.3.5.2 共表达DEGs的GO富集和KEGG分析 | 第47-48页 |
| 2.4 讨论 | 第48-50页 |
| 2.5 小结 | 第50-51页 |
| 第三章 NDV依赖MEK/ERK信号通路诱导SOCS3的产生促进病毒增殖 | 第51-70页 |
| 3.1 材料 | 第51-52页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第51页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第51页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第51-52页 |
| 3.2 方法 | 第52-57页 |
| 3.2.1 质粒构建 | 第52-53页 |
| 3.2.2 SOCS3的原核表达 | 第53-55页 |
| 3.2.2.1 原核表达条件 | 第53页 |
| 3.2.2.2 菌体的收集和超声破碎 | 第53页 |
| 3.2.2.3 包涵体蛋白的洗涤与变性 | 第53-54页 |
| 3.2.2.4 表达产物的SDS–PAGE分析 | 第54-55页 |
| 3.2.2.5 多克隆抗体制备 | 第55页 |
| 3.2.3 鸡胚原代成纤维细胞(CEFs)的制备 | 第55-56页 |
| 3.2.4 间接免疫荧光 | 第56页 |
| 3.2.5 半数组织感染剂量(TCID50)的计算 | 第56页 |
| 3.2.6 细胞活力检测 | 第56页 |
| 3.2.7 荧光定量PCR(q RT-PCR) | 第56页 |
| 3.2.8 细胞转染 | 第56-57页 |
| 3.2.9 免疫印迹(Western Blot) | 第57页 |
| 3.2.10 数据统计 | 第57页 |
| 3.3 结果 | 第57-68页 |
| 3.3.1 SOCS3在转录组数据中的表达 | 第57-58页 |
| 3.3.2 SOCS3多克隆抗体的制备 | 第58-60页 |
| 3.3.2.1 SOCS3的原核表达 | 第58页 |
| 3.3.2.2 原核表达条件的优化 | 第58-59页 |
| 3.3.2.3 Western Blot检测SOCS3-His原核表达蛋白 | 第59页 |
| 3.3.2.4 SOCS3-His包涵体的溶解与变性 | 第59-60页 |
| 3.3.2.5 多克隆抗体识别细胞内源性SOCS3的检测 | 第60页 |
| 3.3.3 NDV的感染诱导SOCS3的表达 | 第60-61页 |
| 3.3.4 NDV V蛋白在诱导SOCS3的表达中发挥主要作用 | 第61-62页 |
| 3.3.5 过表达SOCS3蛋白促进NDV增殖 | 第62-64页 |
| 3.3.6 敲低内源性SOCS3的表达抑制NDV增殖 | 第64-65页 |
| 3.3.7 MEK/ERK信号通路参与NDV诱导的SOCS3表达 | 第65-66页 |
| 3.3.8 抑制MEK/ERK信号通路促进NDV增殖 | 第66-68页 |
| 3.4 讨论 | 第68-69页 |
| 3.5 小结 | 第69-70页 |
| 第四章 gga-miR-455-5p靶向调控SOCS3的表达抑制NDV增殖 | 第70-86页 |
| 4.1 实验材料 | 第70页 |
| 4.1.1 细胞和毒株 | 第70页 |
| 4.1.2 试剂 | 第70页 |
| 4.1.3 仪器 | 第70页 |
| 4.2 实验方法 | 第70-73页 |
| 4.2.1 靶向调控SOCS3表达的mi RNA的预测及筛选 | 第70页 |
| 4.2.2 miRNA靶向NDV基因组序列的筛选 | 第70-71页 |
| 4.2.3 双荧光素酶报告基因系统检测mi RNA与靶基因的结合 | 第71-72页 |
| 4.2.3.1 双荧光素酶报告基因重组质粒构建 | 第71-72页 |
| 4.2.3.2 双荧光素酶报告基因系统检测miRNAs的靶位点 | 第72页 |
| 4.2.3.3 免疫印迹(Western Blot)检测gga-miR-455-5p对NP以及SOCS3蛋白水平的影响 | 第72页 |
| 4.2.4 miRNA455-5p对NDV增殖的影响 | 第72-73页 |
| 4.2.4.1 NDV感染CEF细胞 | 第73页 |
| 4.2.4.2 RT-q PCR检测SOCS3、IRF3、IFN-β、OASL和MX1的相对表达 | 第73页 |
| 4.2.4.3 免疫印迹(WB)检测NDV HN蛋白的表达 | 第73页 |
| 4.2.4.4 噬斑实验和TCID50检测细胞上清中病毒滴度 | 第73页 |
| 4.2.5 数据统计 | 第73页 |
| 4.3 结果 | 第73-83页 |
| 4.3.1 靶向调控SOCS3表达的miRNA筛选 | 第73-74页 |
| 4.3.2 gga-miR-455-5p与SOCS33'UTR特异性结合 | 第74页 |
| 4.3.3 gga-miR-455-5p在m RNA和蛋白水平抑制SOCS3的表达 | 第74-76页 |
| 4.3.4 NDV的感染抑制gga-miR-455-5p的表达 | 第76-77页 |
| 4.3.4.1 NDV感染鸡后抑制gga-miR-455-5p在法氏囊中的表达 | 第76页 |
| 4.3.4.2 NDV感染CEF细胞后抑制gga-miR-455-5p表达 | 第76-77页 |
| 4.3.5 gga-miR-455-5p对NDV增殖的影响 | 第77-80页 |
| 4.3.5.1 gga-miR-455-5p过表达抑制NDV增殖 | 第78-79页 |
| 4.3.5.2 抑制内源性gga-miR-455-5p的表达促进NDV增殖 | 第79-80页 |
| 4.3.6 gga-miR-455-5p在NDV基因组上靶点的预测和验证 | 第80-82页 |
| 4.3.7 gga-miR-455-5p对干扰素和干扰素刺激基因的影响 | 第82-83页 |
| 4.4 讨论 | 第83-85页 |
| 4.5 小结 | 第85-86页 |
| 全文总结 | 第86-87页 |
| 本研究创新点 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-101页 |
| 附录 | 第101-103页 |
| 缩略词及中英文对照表 | 第103-105页 |
| 致谢 | 第105-106页 |
| 个人简历 | 第106页 |
