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肺炎克雷伯氏菌碳代谢流定向调控生产3-羟基丙酸

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肺炎克雷伯氏菌碳代谢流定向调控生产3-羟基丙酸
论文目录
 
学位论文数据集第1-4页
摘要第4-8页
abstract第8-10页
符号说明第19-20页
第一章 文献综述第20-34页
    1.1 3-羟基丙酸概述第20-21页
    1.2 化学合成法生产3-HP第21页
    1.3 微生物发酵法生产3-HP第21-24页
        1.3.1 合成3-HP的天然途径第21-22页
        1.3.2 合成3-HP的代谢工程途径第22-24页
    1.4 生物法合成3-HP的研究进展第24-26页
    1.5 K. pneumoniae及其甘油代谢途径第26-27页
    1.6 碳代谢流的再分配第27-28页
    1.7 合成生物学技术改造非模式生物第28-30页
        1.7.1 微生物信号工程调控细胞表型第28-29页
        1.7.2 正交表达系统第29-30页
        1.7.3 CRISPRi系统介导的基因沉默第30页
    1.8 基因定向敲入策略第30-31页
        1.8.1 自杀载体介导的基因整合第30-31页
        1.8.2 λRed系统介导的基因整合第31页
    1.9 本课题的立项意义第31-34页
第二章 构建环腺苷酸受体蛋白(CRP)介导的人工转录因子定向强化3-HP生产第34-56页
    2.1 引言第34-35页
    2.2 实验材料第35-37页
        2.2.1 菌株、质粒及引物第35-36页
        2.2.2 试剂与仪器第36页
        2.2.3 培养基第36-37页
    2.3 实验方法第37-42页
        2.3.1 融合基因设计第37页
        2.3.2 K. pneumoniae及E. coli基因组的提取第37-38页
        2.3.3 重组质粒载体的提取第38页
        2.3.4 PCR反应扩增目的基因片段与片段的纯化回收第38-39页
        2.3.5 基因片段与载体的酶切反应第39页
        2.3.6 酶切产物的琼脂糖切胶回收第39页
        2.3.7 基因片段与载体的连接反应第39页
        2.3.8 连接液热转化E.coli感受态细胞第39-40页
        2.3.9 重组质粒电转化至宿主菌K.pneumoniae第40页
        2.3.10 重组K.pneumoniae的发酵第40页
        2.3.11 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析醛脱氢酶表达情况第40-41页
        2.3.12 醛脱氢酶酶活的测定第41页
        2.3.13 实时荧光定量PCR分析基因转录水平第41页
        2.3.14 代谢物的测定方法第41-42页
    2.4 结果与讨论第42-55页
        2.4.1 K.pneumoniae与E.coli基因组的提取第42页
        2.4.2 crp+linker、lac1+linker、pkan、cm、lac0、puuC基因的克隆第42-43页
        2.4.3 重组载体pET-pkan-crp-lac1和pET-lac0-pkac-puuC的构建第41-46页
        2.4.4 SDS-PAGE及酶活分析醛脱氢酶表达情况第46-48页
        2.4.5 qRT-PCR分析相关基因的转录情况第48-50页
        2.4.6 摇瓶发酵重组菌产3-HP的研究第50-53页
        2.4.7 重组菌上罐发酵的研究第53-55页
    2.5 本章小结第55-56页
第三章 利用CRISPRi技术构建代谢开关调控K.pneumoniae中3-HP生产第56-74页
    3.1 引言第56-57页
    3.2 实验材料第57-58页
        3.2.1 菌株、质粒及引物第57-58页
        3.2.2 仪器、试剂和培养基第58页
    3.3 实验方法第58-60页
        3.3.1 重组载体的构建第59页
        3.3.2 自杀载体的功能验证第59-60页
        3.3.3 两轮重组整合dCas9基因第60页
        3.3.4 平台工程菌K.p-dCas9功能表征第60页
        3.3.5 代谢开关元件在K. pneumoniae生产3-HP中的应用第60页
    3.4 结果与讨论第60-72页
        3.4.1 基因的克隆及重组载体构建第60-65页
        3.4.2 自杀载体功能表征第65-67页
        3.4.3 dCas9表达盒的基因组整合第67-68页
        3.4.4 荧光分析K.p-dCas9基因沉默功能第68-69页
        3.4.5 在K.pneumoniae中利用代谢切换元件生产3-HP第69-71页
        3.4.6 重组菌K.-p-dCas9(p-switch)的上罐发酵第71-72页
    3.5 本章小结第72-74页
第四章 在K.pneumoniae中建立依赖T7 RNA聚合酶的正交表达系统生产3-HP第74-94页
    4.1 引言第74-75页
    4.2 实验材料第75-76页
        4.2.1 菌种、质粒和引物第75-76页
        4.2.2 仪器、试剂和培养基第76页
    4.3 实验方法第76-78页
        4.3.1 重组载体的构建第77页
        4.3.2 T7正交表达系统的功能表征第77页
        4.3.3 利用载体中的T7正交表达系统调控3-HP生产第77页
        4.3.4 λRed重组整合T7 RNAP第77-78页
        4.3.5 利用平台工程菌K.p-T7表达醛脱氢酶生产3-HP第78页
    4.4 结果与讨论第78-92页
        4.4.1 基因的克隆及重组载体构建第78-81页
        4.4.2 荧光蛋白表征T7系统在K.pneumoniae中的可行性第81-83页
        4.4.3 利用T7表达系统在K. pneumoniae中表达醛脱氢酶第83-84页
        4.4.4 T7表达系统调控K. pneumoniae生产3-HP第84-86页
        4.4.5 λRed重组介导的T7 RNAP基因组整合第86-87页
        4.4.6 平台工程菌K.p-T7表达醛脱氢酶生产3-HP第87-90页
        4.4.7 重组菌K.p-T7 (pET28a-puuC)上罐发酵生产3-HP第90-92页
    4.5 本章小结第92-94页
第五章 利用RNA聚合酶作为资源分配器在K.pneumoniae中最大化生产3-HP第94-112页
    5.1 引言第94-95页
    5.2 实验材料第95-96页
        5.2.1 菌株、质粒及引物第95-96页
        5.2.2 仪器、试剂和培养基第96页
    5.3 实验方法第96-97页
        5.3.1 重组载体的构建第96页
        5.3.2 重组K.pneumoniae(Pntac-puuC)的发酵第96页
        5.3.3 模型分析RNAP与复合启动子Pntac之间数量关系第96-97页
    5.4 结果与讨论第97-109页
        5.4.1 基因的克隆及重组载体构建第97-98页
        5.4.2 SDS-PAGE及酶活分析醛脱氢酶表达情况第98-100页
        5.4.3 qRT-PCR分析相关基因的转录情况第100-101页
        5.4.4 重组菌摇瓶发酵探究复合启动子对代谢物合成的影响第101-102页
        5.4.5 重组菌5L上罐发酵高产3-HP条件探究第102-108页
        5.4.6 数学模型分析复合启动子转录效率第108-109页
    5.5 本章小结第109-112页
第六章 总结与展望第112-114页
    6.1 总结第112-113页
    6.2 展望第113-114页
参考文献第114-120页
附录1 本研究用到的试剂第120-122页
附录2 本研究所用到的仪器第122-124页
致谢第124-126页
已发表的文章第126-128页
作者及导师简介第128-129页
附件第129-130页

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