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重组大肠杆菌4S脱硫途径重构及其关键酶脱敏改造

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重组大肠杆菌4S脱硫途径重构及其关键酶脱敏改造
论文目录
 
摘要第1-7页
Abstract第7-9页
英文缩略词表第14-15页
第一章 绪论第15-45页
    1.1 燃油微生物脱硫概述第15-22页
        1.1.1 国内外燃料油含硫标准第15页
        1.1.2 含硫燃料油脱硫方法简介第15-17页
        1.1.3 脱硫细菌和微生物脱硫途径第17-22页
    1.2 微生物4S脱硫途径的改造以及DszC的描述第22-32页
        1.2.1 基因工程和代谢工程改造4S途径的策略第22-25页
        1.2.2 DszC酶第25-31页
        1.2.3 BDS过程相关的动力学模型第31-32页
    1.3 酶分子定向进化第32-43页
        1.3.1 基因多样化的策略第33-37页
        1.3.2 单基因进化的遗传筛选第37-39页
        1.3.3 功能性蛋白的选择第39-43页
    1.4 本课题的研究意义及主要研究内容第43-45页
        1.4.1 本课题的研究意义第43页
        1.4.2 本课题的主要研究内容第43-45页
第二章 4S途径在大肠杆菌中的重构以及Dsz酶表达量的调节第41-76页
    2.1 引言第45-46页
    2.2 材料与设备第46-50页
        2.2.1 菌株、质粒和引物第46-47页
        2.2.2 主要仪器与设备第47-48页
        2.2.3 主要试剂第48-49页
        2.2.4 培养基与溶液第49-50页
    2.3 实验方法第50-59页
        2.3.1 dsz基因表达载体的构建第50-55页
        2.3.2 脱硫重组菌株的构建第55页
        2.3.3 静息细胞的制备及全细胞反应第55-56页
        2.3.4 Dsz酶反应动力学模型的建立第56页
        2.3.5 Dsz蛋白的表达和纯化第56-58页
        2.3.6 Dsz酶体外反应体系第58页
        2.3.7 高效液相色谱检测第58-59页
    2.4 结果与讨论第59-74页
        2.4.1 dsz基因在E.coli BL21(DE3)中功能表达第59-61页
        2.4.2 Dsz酶反应动力学模型的建立第61-65页
        2.4.3 体外Dsz酶量的调节第61-71页
        2.4.4 体内dsz基因表达量的调节第71-74页
    2.5 本章小结第74-76页
第三章 DszC反馈抑制脱敏突变体高通量筛选方法的建立及突变体催化效率的评价第76-91页
    3.1 引言第76-77页
    3.2 材料与设备第77-78页
        3.2.1 菌株与引物第77页
        3.2.2 主要仪器与设备第77页
        3.2.3 主要试剂第77-78页
        3.2.4 培养基与溶液第78页
    3.3 实验方法第78-81页
        3.3.1 高通量筛选方法的建立第78-80页
        3.3.2 DszC酶活力的测量第80页
        3.3.3 Discovery Studio分子模拟对接第80-81页
    3.4 结果与讨论第81-90页
        3.4.1 DszC酶最适反应温度和最适反应pH第81页
        3.4.2 反馈抑制脱敏突变体高通量筛选方法的建立及筛选结果第81-86页
        3.4.3 DszC突变体A101V催化效率的评价及分子模拟对接第86-90页
    3.5 本章小结第90-91页
第四章 DszC的分子迭代饱和突变对反馈抑制的脱敏第91-108页
    4.1 引言第91页
    4.2 材料与设备第91-94页
        4.2.1 菌株与引物第91-94页
        4.2.2 主要仪器与设备第94页
        4.2.3 主要试剂第94页
        4.2.4 培养基与溶液第94页
    4.3 实验方法第94-95页
        4.3.1 DszC定点突变质粒的构建第94-95页
        4.3.2 DszC突变体酶活力的测量第95页
        4.3.3 含有DszC正突变体的重组菌全细胞催化DBT第95页
        4.3.4 LC-MS分析第95页
    4.4 结果与讨论第95-106页
        4.4.1 DszC定点突变体的构建和筛选第95-100页
        4.4.2 DszC正突变体的酶活力和反馈抑制脱敏效果第100-102页
        4.4.3 含有DszC正突变体重组菌的HBP生产效率第102-103页
        4.4.4 DszC蛋白质工程与过表达的结合第103-106页
    4.5 本章小结第106-108页
第五章 丙氨酸扫描和定点饱和突变提高DszC底物耐受力第108-121页
    5.1 引言第108-109页
    5.2 材料与设备第109-113页
        5.2.1 菌株和引物第109-112页
        5.2.2 主要仪器与设备第112页
        5.2.3 主要试剂第112页
        5.2.4 培养基与溶液第112-113页
    5.3 实验方法第113页
        5.3.1 丙氨酸扫描突变质粒的构建第113页
        5.3.2 丙氨酸扫描突变体的筛选第113页
        5.3.3 定点饱和突变体的筛选第113页
        5.3.4 突变体酶活力的测量和含有突变体重组菌HBP产量的测量第113页
    5.4 结果与讨论第113-119页
        5.4.1 丙氨酸扫描突变体表达质粒的构建和筛选第113-115页
        5.4.2 以AKWC为基础第413 位氨基酸定点饱和突变体的筛选第115-117页
        5.4.3 AWKCPI突变体的酶活力和底物抑制作用的降低第117-118页
        5.4.4 含有AWKCPI突变体重组菌的HBP生产效率第118-119页
    5.5 本章小结第119-121页
结论与展望第121-125页
    结论第121-122页
    本论文创新点第122-123页
    展望第123-125页
参考文献第125-145页
附录第145-156页
攻读博士学位期间取得的研究成果第156-157页
致谢第157-159页
附件第159页

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