论文目录 | |
摘要 | 第1-7页 |
Abstract | 第7-9页 |
英文缩略词表 | 第14-15页 |
第一章 绪论 | 第15-45页 |
1.1 燃油微生物脱硫概述 | 第15-22页 |
1.1.1 国内外燃料油含硫标准 | 第15页 |
1.1.2 含硫燃料油脱硫方法简介 | 第15-17页 |
1.1.3 脱硫细菌和微生物脱硫途径 | 第17-22页 |
1.2 微生物4S脱硫途径的改造以及DszC的描述 | 第22-32页 |
1.2.1 基因工程和代谢工程改造4S途径的策略 | 第22-25页 |
1.2.2 DszC酶 | 第25-31页 |
1.2.3 BDS过程相关的动力学模型 | 第31-32页 |
1.3 酶分子定向进化 | 第32-43页 |
1.3.1 基因多样化的策略 | 第33-37页 |
1.3.2 单基因进化的遗传筛选 | 第37-39页 |
1.3.3 功能性蛋白的选择 | 第39-43页 |
1.4 本课题的研究意义及主要研究内容 | 第43-45页 |
1.4.1 本课题的研究意义 | 第43页 |
1.4.2 本课题的主要研究内容 | 第43-45页 |
第二章 4S途径在大肠杆菌中的重构以及Dsz酶表达量的调节 | 第41-76页 |
2.1 引言 | 第45-46页 |
2.2 材料与设备 | 第46-50页 |
2.2.1 菌株、质粒和引物 | 第46-47页 |
2.2.2 主要仪器与设备 | 第47-48页 |
2.2.3 主要试剂 | 第48-49页 |
2.2.4 培养基与溶液 | 第49-50页 |
2.3 实验方法 | 第50-59页 |
2.3.1 dsz基因表达载体的构建 | 第50-55页 |
2.3.2 脱硫重组菌株的构建 | 第55页 |
2.3.3 静息细胞的制备及全细胞反应 | 第55-56页 |
2.3.4 Dsz酶反应动力学模型的建立 | 第56页 |
2.3.5 Dsz蛋白的表达和纯化 | 第56-58页 |
2.3.6 Dsz酶体外反应体系 | 第58页 |
2.3.7 高效液相色谱检测 | 第58-59页 |
2.4 结果与讨论 | 第59-74页 |
2.4.1 dsz基因在E.coli BL21(DE3)中功能表达 | 第59-61页 |
2.4.2 Dsz酶反应动力学模型的建立 | 第61-65页 |
2.4.3 体外Dsz酶量的调节 | 第61-71页 |
2.4.4 体内dsz基因表达量的调节 | 第71-74页 |
2.5 本章小结 | 第74-76页 |
第三章 DszC反馈抑制脱敏突变体高通量筛选方法的建立及突变体催化效率的评价 | 第76-91页 |
3.1 引言 | 第76-77页 |
3.2 材料与设备 | 第77-78页 |
3.2.1 菌株与引物 | 第77页 |
3.2.2 主要仪器与设备 | 第77页 |
3.2.3 主要试剂 | 第77-78页 |
3.2.4 培养基与溶液 | 第78页 |
3.3 实验方法 | 第78-81页 |
3.3.1 高通量筛选方法的建立 | 第78-80页 |
3.3.2 DszC酶活力的测量 | 第80页 |
3.3.3 Discovery Studio分子模拟对接 | 第80-81页 |
3.4 结果与讨论 | 第81-90页 |
3.4.1 DszC酶最适反应温度和最适反应pH | 第81页 |
3.4.2 反馈抑制脱敏突变体高通量筛选方法的建立及筛选结果 | 第81-86页 |
3.4.3 DszC突变体A101V催化效率的评价及分子模拟对接 | 第86-90页 |
3.5 本章小结 | 第90-91页 |
第四章 DszC的分子迭代饱和突变对反馈抑制的脱敏 | 第91-108页 |
4.1 引言 | 第91页 |
4.2 材料与设备 | 第91-94页 |
4.2.1 菌株与引物 | 第91-94页 |
4.2.2 主要仪器与设备 | 第94页 |
4.2.3 主要试剂 | 第94页 |
4.2.4 培养基与溶液 | 第94页 |
4.3 实验方法 | 第94-95页 |
4.3.1 DszC定点突变质粒的构建 | 第94-95页 |
4.3.2 DszC突变体酶活力的测量 | 第95页 |
4.3.3 含有DszC正突变体的重组菌全细胞催化DBT | 第95页 |
4.3.4 LC-MS分析 | 第95页 |
4.4 结果与讨论 | 第95-106页 |
4.4.1 DszC定点突变体的构建和筛选 | 第95-100页 |
4.4.2 DszC正突变体的酶活力和反馈抑制脱敏效果 | 第100-102页 |
4.4.3 含有DszC正突变体重组菌的HBP生产效率 | 第102-103页 |
4.4.4 DszC蛋白质工程与过表达的结合 | 第103-106页 |
4.5 本章小结 | 第106-108页 |
第五章 丙氨酸扫描和定点饱和突变提高DszC底物耐受力 | 第108-121页 |
5.1 引言 | 第108-109页 |
5.2 材料与设备 | 第109-113页 |
5.2.1 菌株和引物 | 第109-112页 |
5.2.2 主要仪器与设备 | 第112页 |
5.2.3 主要试剂 | 第112页 |
5.2.4 培养基与溶液 | 第112-113页 |
5.3 实验方法 | 第113页 |
5.3.1 丙氨酸扫描突变质粒的构建 | 第113页 |
5.3.2 丙氨酸扫描突变体的筛选 | 第113页 |
5.3.3 定点饱和突变体的筛选 | 第113页 |
5.3.4 突变体酶活力的测量和含有突变体重组菌HBP产量的测量 | 第113页 |
5.4 结果与讨论 | 第113-119页 |
5.4.1 丙氨酸扫描突变体表达质粒的构建和筛选 | 第113-115页 |
5.4.2 以AKWC为基础第413 位氨基酸定点饱和突变体的筛选 | 第115-117页 |
5.4.3 AWKCPI突变体的酶活力和底物抑制作用的降低 | 第117-118页 |
5.4.4 含有AWKCPI突变体重组菌的HBP生产效率 | 第118-119页 |
5.5 本章小结 | 第119-121页 |
结论与展望 | 第121-125页 |
结论 | 第121-122页 |
本论文创新点 | 第122-123页 |
展望 | 第123-125页 |
参考文献 | 第125-145页 |
附录 | 第145-156页 |
攻读博士学位期间取得的研究成果 | 第156-157页 |
致谢 | 第157-159页 |
附件 | 第159页 |