论文目录 | |
| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 缩略词与术语表 | 第10-14页 |
| 第1章 综述 | 第14-35页 |
| 1.1 引言 | 第14-15页 |
| 1.2 微生物药物优质高产机制研究进展 | 第15-28页 |
| 1.2.1 微生物药物高产研究进展 | 第16-22页 |
| 1.2.1.1 异源表达 | 第17页 |
| 1.2.1.2 途径特异性调控 | 第17-19页 |
| 1.2.1.3 多效调控基因调控 | 第19-20页 |
| 1.2.1.4 基因簇的特异性高表达策略 | 第20-22页 |
| 1.2.2 微生物药物优质生产研究进展 | 第22-28页 |
| 1.2.2.1 合成前体的代谢优化 | 第22-23页 |
| 1.2.2.2 合成酶的优化 | 第23-25页 |
| 1.2.2.3 体外信号的诱导 | 第25-28页 |
| 1.3 达托霉素合成与调控机制 | 第28-34页 |
| 1.3.1 达托霉素的生物合成 | 第29-31页 |
| 1.3.2 达托霉素及其同系物的脂肪酸前体合成 | 第31-32页 |
| 1.3.3 达托霉素合成调控机制研究 | 第32-34页 |
| 1.4 本文立项依据 | 第34-35页 |
| 第2章 多效调控因子体内筛选体系的建立及应用 | 第35-73页 |
| 2.1 引言 | 第35-36页 |
| 2.2 实验材料 | 第36-42页 |
| 2.2.1 菌株 | 第36页 |
| 2.2.2 质粒 | 第36-37页 |
| 2.2.3 引物 | 第37-39页 |
| 2.2.4 培养基 | 第39-40页 |
| 2.2.5 主要仪器设备 | 第40-41页 |
| 2.2.6 常用试剂 | 第41-42页 |
| 2.3 实验方法 | 第42-55页 |
| 2.3.1 大肠杆菌质粒的抽提 | 第42页 |
| 2.3.2 PCR技术及条件 | 第42-43页 |
| 2.3.3 核酸片段的回收 | 第43页 |
| 2.3.4 DNA片段的限制性内切酶酶切和连接 | 第43页 |
| 2.3.5 质粒的构建 | 第43-45页 |
| 2.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第45页 |
| 2.3.7 接合转导技术 | 第45-46页 |
| 2.3.8 玫瑰孢链霉菌的孢子收集 | 第46页 |
| 2.3.9 链霉菌基因组的抽提 | 第46-47页 |
| 2.3.10 cosmid拯救质粒的构建 | 第47-48页 |
| 2.3.11 玫瑰孢链霉菌的摇瓶发酵 | 第48页 |
| 2.3.12 玫瑰孢链霉菌的上罐发酵 | 第48页 |
| 2.3.13 达托霉素的HPLC检测 | 第48-49页 |
| 2.3.14 大肠杆菌中His标签蛋白的诱导表达与纯化 | 第49-50页 |
| 2.3.15 蛋白SDS-PAGE鉴定 | 第50页 |
| 2.3.16 eGFP蛋白的western blot检测 | 第50-51页 |
| 2.3.17 凝胶迁移阻滞电泳(EMSAs) | 第51-52页 |
| 2.3.18 DNase I footprintings | 第52页 |
| 2.3.19 RNA的抽提与基因组DNA的消解 | 第52-53页 |
| 2.3.20 反转录与qRT-PCR | 第53-55页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第55-71页 |
| 2.4.1 基于Himar1转座系统的链霉菌多效调控因子筛选体系构建 | 第55-56页 |
| 2.4.2 多效调控因子筛选体系在玫瑰饱链霉菌中的应用 | 第56-60页 |
| 2.4.3 转座子插入位点的定位 | 第60-61页 |
| 2.4.4 PhaR蛋白的结构 | 第61-62页 |
| 2.4.5 PhaR蛋白直接负调控dptEp启动子的活性 | 第62-65页 |
| 2.4.6 PhaR蛋白正调控自身基因的表达和影响菌株形态发育 | 第65-68页 |
| 2.4.7 ΔphaR菌株的达托霉素高产发酵 | 第68-71页 |
| 2.5 小结 | 第71-73页 |
| 第3章 达托霉素生物合成的级联调控分子机制研究 | 第73-100页 |
| 3.1 引言 | 第73-74页 |
| 3.2 实验材料 | 第74-77页 |
| 3.2.1 菌株 | 第74页 |
| 3.2.2 质粒 | 第74-75页 |
| 3.2.3 引物 | 第75-76页 |
| 3.2.4 培养基 | 第76-77页 |
| 3.2.5 仪器设备 | 第77页 |
| 3.3 实验方法 | 第77-82页 |
| 3.3.1 PCR,限制性内切酶酶切等分子生物学操作 | 第77页 |
| 3.3.2 链霉菌遗传操作及发酵 | 第77页 |
| 3.3.3 质粒的构建 | 第77-78页 |
| 3.3.4 DNA-Affinity实验操作流程 | 第78-80页 |
| 3.3.5 邻苯二酚-2,3-双加氧酶活性的测定 | 第80页 |
| 3.3.6 基因同框敲除技术 | 第80-81页 |
| 3.3.7 Southern blot | 第81-82页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第82-98页 |
| 3.4.1 DNA-Affinity法分离鉴定dptEp启动子结合蛋白 | 第82-83页 |
| 3.4.2 AtrA与dptEp启动子的特异性结合 | 第83-87页 |
| 3.4.3 AtrA蛋白正调控dptEp的启动子活性和达托霉素生产 | 第87-89页 |
| 3.4.4 AdpA蛋白是达托霉素合成的必需因子 | 第89-91页 |
| 3.4.5 AdpA蛋白正调控atrA基因的表达 | 第91-93页 |
| 3.4.6 arpA基因的缺失加速菌丝形态分化并提高达托霉素产量 | 第93-96页 |
| 3.4.7 atrA基因自调控机制研究 | 第96-98页 |
| 3.5 小结 | 第98-100页 |
| 第4章 达托霉素同系物生物合成的调控机制 | 第100-122页 |
| 4.1 引言 | 第100-101页 |
| 4.2 实验材料 | 第101-104页 |
| 4.2.1 菌株 | 第101页 |
| 4.2.2 质粒 | 第101-102页 |
| 4.2.3 引物 | 第102-104页 |
| 4.2.4 培养基 | 第104页 |
| 4.2.5 仪器设备 | 第104页 |
| 4.3 实验方法 | 第104-106页 |
| 4.3.1 PCR,限制性内切酶酶切等分子生物学操作 | 第104页 |
| 4.3.2 链霉菌遗传操作及发酵 | 第104-105页 |
| 4.3.3 质粒的构建 | 第105页 |
| 4.3.4 A21978C_(1-3)的HPLC分离及鉴定 | 第105-106页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第106-120页 |
| 4.4.1 达托霉素与A21978C_(1-3)的检测与鉴定 | 第106-108页 |
| 4.4.2 玫瑰孢链霉菌中的BCDH complex以及BkdR调控蛋白 | 第108-109页 |
| 4.4.3 BkdR蛋白直接正调控转录bkdA2B2C2基因簇的转录 | 第109-113页 |
| 4.4.4 BkdR蛋白的负调控自身基因的表达 | 第113-114页 |
| 4.4.5 BkdR是达托霉素及其同系物合成的必需因子 | 第114-117页 |
| 4.4.6 bkdA1B1C1基因簇和bkdA2B2C2基因簇的功能研究 | 第117-120页 |
| 4.5 小结 | 第120-122页 |
| 第5章 研究成果及展望 | 第122-124页 |
| 5.1 本文研究成果 | 第122页 |
| 5.2 展望 | 第122-124页 |
| 参考文献 | 第124-131页 |
| 攻读博士期间主要研究成果 | 第131-132页 |
| 致谢 | 第132页 |
