论文目录 | |
摘要 | 第1-10
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Abstract | 第10-12
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第一章 前言 | 第12-23
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· 水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的研究概况 | 第12-17
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· 水稻条纹叶枯病的基础生物学研究概况 | 第12
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· RSV的分子生物学研究 | 第12-17
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· RSV的分类地位 | 第12
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· RSV粒体形态 | 第12-13
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· RSV的基因组结构与功能 | 第13-16
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· RNA1区段 | 第14
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· RNA2区段 | 第14-15
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· RNA3区段 | 第15-16
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· RNA4区段 | 第16
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· RSV的分子变异 | 第16
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· 水稻条纹叶枯病的防治 | 第16-17
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· 蛋白质研究进展 | 第17-22
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· 外源基因表达 | 第17-20
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· RSV的原核表达 | 第18
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· 真核表达 | 第18
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· 杆状病毒—昆虫细胞表达系统 | 第18-20
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· 杆状病毒昆虫细胞表达系统研究概况 | 第18-19
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· 杆状病毒与细胞凋亡 | 第19-20
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· 蛋白质功能研究 | 第20-22
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· 蛋白质与核酸互作 | 第20-21
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· 蛋白质间相互作用的研究 | 第21
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· 蛋白质的亚细胞定位 | 第21-22
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· 本研究的目的和意义 | 第22-23
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第二章 RSV五个基因真核“AcMNPV-sf9昆虫细胞”表达体系的建立 | 第23-50
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· 材料与方法 | 第23-32
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· 材料 | 第23
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· 病毒 | 第23
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· 昆虫 | 第23
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· 菌株 | 第23
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· 质粒 | 第23
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· 试剂及仪器 | 第23-25
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· 方法 | 第25-32
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· 常规克隆 | 第25-28
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· 水稻病叶总RNA的提取 | 第25
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· 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) | 第25-26
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· DNA片段的切胶纯化 | 第26
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· PCR扩增产物和pMD18-T克隆载体的连接 | 第26
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· 感受态细胞的制备 | 第26-27
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· 连接反应物对宿主感受态细胞的转化 | 第27
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· 质粒提取 | 第27
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· 重组克隆的PCR筛选 | 第27
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· 重组克隆的酶切鉴定 | 第27-28
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· AcMNPV-sf9细胞真核表达体系(步骤见图2-3,示意图见附录4) | 第28-32
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· 重组AcMNPV穿梭质粒的构建及鉴定(bacmid转座原理示意图见附录5) | 第29
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· 核苷酸序列测定 | 第29-30
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· 收获重组AcMNPV | 第30
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· 噬菌斑纯化鉴定实验 | 第30
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· 重组蛋白的表达纯化 | 第30
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· 纯化蛋白抗血清的制备 | 第30-31
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· Western blotting鉴定 | 第31-32
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· 结果与分析 | 第32-45
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· AcMNPV转移载体pFastBacHTb及穿梭载体bacmid鉴定 | 第32-33
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· sf9细胞及其生长曲线 | 第33-34
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· 构建重组AcMNPV转移质粒pFastBacHTb-X | 第34-36
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· 重组AcMNPV穿梭质粒的构建与鉴定 | 第36-39
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· 重组RSV蛋白的表达 | 第39-44
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· rb-X转染sf9昆虫细胞 | 第39
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· 重组AcMNPV的收集、纯化和扩增 | 第39-40
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· 优化表达时间 | 第40-44
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· NS_3特异性抗血清的制备 | 第44-45
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· NS_3的纯化 | 第44-45
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· 间接ELISA法测定抗血清效价 | 第45
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· 讨论 | 第45-50
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· RSV蛋白的获取 | 第45-46
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· 表达体系的选择 | 第46-47
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· 影响表达的因素 | 第47-49
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· 通过真核表达制备RSV各蛋白的抗血清 | 第49-50
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第三章 GFP-SP、GFP-CP融合基因在sf9细胞中的表达 | 第50-66
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· 材料与方法 | 第50-52
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· 病毒,载体,昆虫和试剂 参见第一章 | 第50
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· 方法 | 第50-52
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· 常规克隆方法 | 第50
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· 病叶总RNA提取 | 第50
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· PCR与overlap-PCR | 第50-51
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· 重组AcMNPV转移质粒pFastBacHTb-GFP、pFastBacHTb-GFP-CP和pFast-GFP-SP的构建 | 第51-52
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· 重组AcMNPV穿梭质粒的构建与鉴定 | 第52
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· sf9份细胞的培养、转染与观察 | 第52
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· 重组AcMNPV粒子的收获及鉴定 | 第52
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· 结果与分析 | 第52-63
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· 绿色荧光蛋白GFP的活化 | 第52-53
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· 构建重组AcMNPV转移质粒PFastBacHTb-GFP-X | 第53-54
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· 重组AcMNPV穿梭质粒的构建及鉴定 | 第54-55
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· GFP-SP融合蛋白在sf9昆虫细胞中的表达 | 第55-60
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· GFP-SP融合蛋白在sf9细胞中的激光共聚焦观察 | 第60-63
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· 讨论 | 第63-66
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· overlap-PCR的应用 | 第63-64
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· 包涵体的形成 | 第64
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· 重组质粒与细胞凋亡 | 第64-65
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· SP的亚细胞定位 | 第65-66
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第四章 全文总结 | 第66-68
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参考文献 | 第68-76
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附录1 缩写词英汉对照 | 第76-78
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附录2 本研究使用的主要试剂与溶液的配制 | 第78-82
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附录3 实验所用“AcMNPV-sf9昆虫细胞”表达系统示意图培养 | 第82-83
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附录4 穿梭质粒bacmid转座原理示意图 | 第83-84
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附录5 sf9昆虫细胞培养 | 第84-85
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附录6 缓冲体系及咪唑浓度参考表 | 第85-86
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附录7 RSV各蛋白的分泌性预测结果 | 第86-87
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附录8 本研究构建的序列 | 第87-91
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附录9 RSV NS_2、NS_3、CP、SP和NSvc_4蛋白的亚细胞定位预测 | 第91-92
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附录10 overlap-PCR原理示意图 | 第92-93
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附录11 攻博期间发表(投稿)的论文目录 | 第93-94
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致谢 | 第94页 |