论文目录 | |
摘要 | 第1-8
页 |
Abstract | 第8-10
页 |
前言 | 第10-15
页 |
第一部分 羟胺切割Neurturin融合蛋白表达载体的构建、在大肠杆菌中表达和产物纯化 | 第15-23
页 |
一、实验材料和方法 | 第15-18
页 |
(一)、实验材料 | 第15-16
页 |
·质粒和菌株 | 第15
页 |
·工具酶及试剂 | 第15-16
页 |
·引物 | 第16
页 |
(二)、实验方法 | 第16-18
页 |
·含羟胺切点的pThioHisA—hNTN表达载体的构建 | 第16-17
页 |
·含羟胺切点的pThioHisA—hNTN在大肠杆菌中的表达 | 第17
页 |
·融合蛋白的羟胺切割及产物纯化 | 第17
页 |
·EhNTN的复性 | 第17-18
页 |
·纯化的EhNTN的非还原SDS-PAGE电泳鉴定 | 第18
页 |
·表达产物的Western blot分析 | 第18
页 |
二、结果和分析 | 第18-21
页 |
(一)、含羟胺切割位点pThioHisA—hNTN表达载体的构建 | 第18-19
页 |
(二)、含羟胺位点pThioHisA—hNTN融合蛋白在大肠杆菌中表达 | 第19-20
页 |
(三)、融合蛋白的羟胺切割及纯化 | 第20
页 |
(四)、纯化的EhNTN的非还原电泳结果 | 第20-21
页 |
(五)、表达产物的Western blot分析结果 | 第21
页 |
三、讨论 | 第21-23
页 |
第二部分 神经营养因子Neurturin在毕赤酵母中分泌表达、纯化 | 第23-36
页 |
一、实验材料和方法 | 第23-27
页 |
(一)、实验材料 | 第23-24
页 |
·菌株和质粒 | 第23-24
页 |
·工具酶和试剂 | 第24
页 |
(二)、实验方法 | 第24-27
页 |
·NTN全基因合成 | 第24-25
页 |
·α-hNTN融合基因的获得 | 第25-26
页 |
·pPIC9K-α-hNTN表达载体的构建 | 第26
页 |
·转化毕赤酵母GS115 | 第26
页 |
·G418筛选多拷贝转化子 | 第26
页 |
·在毕赤酵母菌中诱导表达重组的人NTN | 第26
页 |
·Western blot分析 | 第26
页 |
·毕赤酵母表达的YhNTN的纯化 | 第26-27
页 |
·纯化的YhNTN的非还原SDS-PAGE电泳鉴定 | 第27
页 |
·重组蛋白糖含量分析 | 第27
页 |
二、结果和分析 | 第27-31
页 |
(一)、人NTN全基因合成及α-hNTN融合基因的获得 | 第27-28
页 |
(二)、pPIC9K-hNTN表达载体的构建及序列分析 | 第28
页 |
(三)、转化毕赤酵母GS115并筛选稳定的多拷贝转化子 | 第28
页 |
(四)、在毕赤酵母中诱导表达重组的人NTN | 第28
页 |
(五)、Western Blot分析结果 | 第28-29
页 |
(六)、毕赤酵母表达YhNTN的纯化 | 第29
页 |
(七)、纯化的YhNTN的非还原电泳结果 | 第29-31
页 |
(八)、重组蛋白糖含量分析 | 第31
页 |
三、讨论 | 第31-36
页 |
第三部分 重组hNTN的生物学活性鉴定 | 第36-58
页 |
一、实验材料和方法 | 第36-39
页 |
(一)、实验材料 | 第36-37
页 |
·试剂及抗体 | 第36
页 |
·培养基及重组蛋白 | 第36-37
页 |
·实验动物 | 第37
页 |
(二)、实验方法 | 第37-39
页 |
·鸡胚背根神经节培养实验 | 第37
页 |
·胚胎大鼠中脑多巴胺能神经元培养实验 | 第37-38
页 |
(1) 多巴胺能神经元细胞培养 | 第37
页 |
(2) 酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色观察体外培养的神经元 | 第37-38
页 |
·重组hNTN对大鼠面神经损伤的保护作用 | 第38
页 |
(1) 实验动物及分组 | 第38
页 |
(2) 面神经损伤模型的建立及观察重组hNTN对神经元的保护作用 | 第38
页 |
·重组hNTN对恒河猴帕金森氏病模型中多巴胺能神经元的保护作用 | 第38-39
页 |
(1) 动物分组与用药 | 第38
页 |
(2) 神经生化测定 | 第38-39
页 |
(3) 组织病理切片 | 第39
页 |
二、结果与分析 | 第39-54
页 |
(一)、鸡胚背根神经节培养 | 第39
页 |
(二)、胚胎大鼠中脑多巴胺能神经元培养 | 第39-46
页 |
·多巴胺能神经元细胞活体直接观察 | 第39-42
页 |
·TH免疫细胞学化染色观察结果 | 第42-46
页 |
(三)、大鼠面神经损伤模型实验结果 | 第46-48
页 |
·组织病理切片观察 | 第46
页 |
·面神经核观察及记数 | 第46-48
页 |
(四)、恒河猴帕金森氏病模型实验结果 | 第48-54
页 |
·行为观察 | 第48-50
页 |
(1) 急性反应 | 第48-49
页 |
(2) PD症状 | 第49-50
页 |
·神经生化改变 | 第50-52
页 |
·神经病理改变 | 第52-54
页 |
三、讨论 | 第54-58
页 |
小结 | 第58-59
页 |
展望 | 第59-60
页 |
论文参考文献 | 第60-67
页 |
论文综述1 | 第67-80
页 |
论文综述2 | 第80-93
页 |
附录 | 第93-108
页 |
致谢 | 第108-109
页 |
研究生简历 | 第109页 |