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神经营养因子Neurturin在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性研究

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神经营养因子Neurturin在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性研究
论文目录
 
摘要第1-8 页
Abstract第8-10 页
前言第10-15 页
第一部分 羟胺切割Neurturin融合蛋白表达载体的构建、在大肠杆菌中表达和产物纯化第15-23 页
  一、实验材料和方法第15-18 页
    (一)、实验材料第15-16 页
      ·质粒和菌株第15 页
      ·工具酶及试剂第15-16 页
      ·引物第16 页
    (二)、实验方法第16-18 页
      ·含羟胺切点的pThioHisA—hNTN表达载体的构建第16-17 页
      ·含羟胺切点的pThioHisA—hNTN在大肠杆菌中的表达第17 页
      ·融合蛋白的羟胺切割及产物纯化第17 页
      ·EhNTN的复性第17-18 页
      ·纯化的EhNTN的非还原SDS-PAGE电泳鉴定第18 页
      ·表达产物的Western blot分析第18 页
  二、结果和分析第18-21 页
    (一)、含羟胺切割位点pThioHisA—hNTN表达载体的构建第18-19 页
    (二)、含羟胺位点pThioHisA—hNTN融合蛋白在大肠杆菌中表达第19-20 页
    (三)、融合蛋白的羟胺切割及纯化第20 页
    (四)、纯化的EhNTN的非还原电泳结果第20-21 页
    (五)、表达产物的Western blot分析结果第21 页
  三、讨论第21-23 页
第二部分 神经营养因子Neurturin在毕赤酵母中分泌表达、纯化第23-36 页
  一、实验材料和方法第23-27 页
    (一)、实验材料第23-24 页
      ·菌株和质粒第23-24 页
      ·工具酶和试剂第24 页
    (二)、实验方法第24-27 页
      ·NTN全基因合成第24-25 页
      ·α-hNTN融合基因的获得第25-26 页
      ·pPIC9K-α-hNTN表达载体的构建第26 页
      ·转化毕赤酵母GS115第26 页
      ·G418筛选多拷贝转化子第26 页
      ·在毕赤酵母菌中诱导表达重组的人NTN第26 页
      ·Western blot分析第26 页
      ·毕赤酵母表达的YhNTN的纯化第26-27 页
      ·纯化的YhNTN的非还原SDS-PAGE电泳鉴定第27 页
      ·重组蛋白糖含量分析第27 页
  二、结果和分析第27-31 页
    (一)、人NTN全基因合成及α-hNTN融合基因的获得第27-28 页
    (二)、pPIC9K-hNTN表达载体的构建及序列分析第28 页
    (三)、转化毕赤酵母GS115并筛选稳定的多拷贝转化子第28 页
    (四)、在毕赤酵母中诱导表达重组的人NTN第28 页
    (五)、Western Blot分析结果第28-29 页
    (六)、毕赤酵母表达YhNTN的纯化第29 页
    (七)、纯化的YhNTN的非还原电泳结果第29-31 页
    (八)、重组蛋白糖含量分析第31 页
  三、讨论第31-36 页
第三部分 重组hNTN的生物学活性鉴定第36-58 页
  一、实验材料和方法第36-39 页
    (一)、实验材料第36-37 页
      ·试剂及抗体第36 页
      ·培养基及重组蛋白第36-37 页
      ·实验动物第37 页
    (二)、实验方法第37-39 页
      ·鸡胚背根神经节培养实验第37 页
      ·胚胎大鼠中脑多巴胺能神经元培养实验第37-38 页
        (1) 多巴胺能神经元细胞培养第37 页
        (2) 酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色观察体外培养的神经元第37-38 页
      ·重组hNTN对大鼠面神经损伤的保护作用第38 页
        (1) 实验动物及分组第38 页
        (2) 面神经损伤模型的建立及观察重组hNTN对神经元的保护作用第38 页
      ·重组hNTN对恒河猴帕金森氏病模型中多巴胺能神经元的保护作用第38-39 页
        (1) 动物分组与用药第38 页
        (2) 神经生化测定第38-39 页
        (3) 组织病理切片第39 页
  二、结果与分析第39-54 页
    (一)、鸡胚背根神经节培养第39 页
    (二)、胚胎大鼠中脑多巴胺能神经元培养第39-46 页
      ·多巴胺能神经元细胞活体直接观察第39-42 页
      ·TH免疫细胞学化染色观察结果第42-46 页
    (三)、大鼠面神经损伤模型实验结果第46-48 页
      ·组织病理切片观察第46 页
      ·面神经核观察及记数第46-48 页
    (四)、恒河猴帕金森氏病模型实验结果第48-54 页
      ·行为观察第48-50 页
        (1) 急性反应第48-49 页
        (2) PD症状第49-50 页
      ·神经生化改变第50-52 页
      ·神经病理改变第52-54 页
  三、讨论第54-58 页
小结第58-59 页
展望第59-60 页
论文参考文献第60-67 页
论文综述1第67-80 页
论文综述2第80-93 页
附录第93-108 页
致谢第108-109 页
研究生简历第109页

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