论文目录 | |
| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-13页 |
| 英文缩略词表 | 第13-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-37页 |
| 1.1 重组蛋白分泌途径概述 | 第14-19页 |
| 1.1.1 核糖体合成的调控及新生肽链与内质网的作用 | 第15-16页 |
| 1.1.2 重组蛋白在内质网中的加工与调控 | 第16-19页 |
| 1.1.3 重组蛋白在高尔基体中的加工 | 第19页 |
| 1.2 内质网稳态与未折叠蛋白响应机制 | 第19-21页 |
| 1.2.1 内质网压力与内质网稳态 | 第19-20页 |
| 1.2.2 未折叠蛋白响应机制与内质网稳态形成 | 第20-21页 |
| 1.3 毕赤酵母重组蛋白表达系统及应用 | 第21-25页 |
| 1.3.1 毕赤酵母表达系统的优势 | 第21-22页 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达系统存在的问题和解决方案 | 第22-23页 |
| 1.3.3 植酸酶及其在毕赤酵母中表达的研究进展 | 第23-25页 |
| 1.4 毕赤酵母重组蛋白高效分泌表达的主要策略 | 第25-32页 |
| 1.4.1 重组蛋白基因表达盒元件的优化 | 第25-27页 |
| 1.4.2 重组蛋白基因表达盒剂量的优化 | 第27-28页 |
| 1.4.3 蛋白质折叠通量的优化 | 第28-29页 |
| 1.4.4 蛋白分泌运输途径的优化 | 第29-30页 |
| 1.4.5 蛋白降解途径的优化 | 第30-31页 |
| 1.4.6 初级代谢途径的改造 | 第31页 |
| 1.4.7 利用组学对可提高重组蛋白表达量的靶标基因进行筛选 | 第31-32页 |
| 1.5 毕赤酵母蛋白质组学研究概述 | 第32-34页 |
| 1.5.1 基于iTRAQ的蛋白质组学研究方法简介 | 第32-33页 |
| 1.5.2 毕赤酵母蛋白质组学研究进展 | 第33-34页 |
| 1.6 本课题的研究意义与主要研究内容 | 第34-37页 |
| 1.6.1 本课题的研究背景和研究意义 | 第34-35页 |
| 1.6.2 本课题的主要研究内容 | 第35-37页 |
| 第二章 基于增加基因剂量和蛋白折叠通量的高表达植酸酶毕赤酵母重组菌株的构建 | 第37-74页 |
| 2.1 引言 | 第37-38页 |
| 2.2 材料与设备 | 第38-44页 |
| 2.2.1 质粒、菌株与引物 | 第38-40页 |
| 2.2.2 主要仪器与设备 | 第40-41页 |
| 2.2.3 主要试剂 | 第41-42页 |
| 2.2.4 主要培养基与溶液的配制 | 第42-44页 |
| 2.3 实验方法 | 第44-59页 |
| 2.3.1 植酸酶Phy毕赤酵母表达载体pPICHKA-phy的构建 | 第44-47页 |
| 2.3.2 优化启动子和信号肽序列重组载体的构建 | 第47-51页 |
| 2.3.3 利用同尾酶构建含多拷贝PHY表达盒的重组载体 | 第51-53页 |
| 2.3.4 表达HSF1R206S重组载体的构建 | 第53-54页 |
| 2.3.5 毕赤酵母重组菌株的构建 | 第54-55页 |
| 2.3.6 重组菌株PHY拷贝数的鉴定 | 第55-56页 |
| 2.3.7 重组菌株植酸酶产量的比较 | 第56-58页 |
| 2.3.8 目的蛋白的检测 | 第58页 |
| 2.3.9 菌株遗传稳定性的检测 | 第58-59页 |
| 2.3.10 基因转录水平的检测 | 第59页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第59-73页 |
| 2.4.1 分泌表达植酸酶重组菌株的构建 | 第59-62页 |
| 2.4.2 基于增加基因剂量的过表达植酸酶重组菌株的构建 | 第62-68页 |
| 2.4.3 基于增加蛋白折叠通量的高表达植酸酶重组菌株的构建 | 第68-71页 |
| 2.4.4 高表达植酸酶重组菌株遗传稳定性的检测 | 第71页 |
| 2.4.5 高表达植酸酶重组菌株在10L发酵罐的产酶分析 | 第71-73页 |
| 2.5 本章小结 | 第73-74页 |
| 第三章 高表达植酸酶重组菌株的蛋白合成网络分析 | 第74-103页 |
| 3.1 引言 | 第74-75页 |
| 3.2 材料与设备 | 第75-78页 |
| 3.2.1 质粒、菌株与引物 | 第75-77页 |
| 3.2.2 主要仪器与设备 | 第77页 |
| 3.2.3 主要试剂 | 第77-78页 |
| 3.2.4 主要培养基与溶液的配制 | 第78页 |
| 3.3 实验方法 | 第78-88页 |
| 3.3.1 基于Cre/loxP系统的筛选标记重复利用的重组载体的构建与应用 | 第78-82页 |
| 3.3.2 重组菌株的发酵与产酶检测 | 第82-84页 |
| 3.3.3 基于iTRAQ技术的重组菌株胞内总蛋白的分析 | 第84-87页 |
| 3.3.4 基因转录水平和rRNA相对水平的检测 | 第87-88页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第88-102页 |
| 3.4.1 高表达植酸酶对细胞途径的调控网络分析 | 第88-100页 |
| 3.4.2 qRT-PCR转录水平对差异蛋白的验证 | 第100-102页 |
| 3.5 本章小结 | 第102-103页 |
| 第四章 高表达植酸酶对内质网扩张的影响 | 第103-111页 |
| 4.1 引言 | 第103页 |
| 4.2 材料与设备 | 第103-104页 |
| 4.2.1 质粒、菌株与引物 | 第103-104页 |
| 4.2.2 主要仪器与设备 | 第104页 |
| 4.2.3 主要试剂 | 第104页 |
| 4.2.4 主要培养基与溶液的配制 | 第104页 |
| 4.3 实验方法 | 第104-106页 |
| 4.3.1 毕赤酵母内质网扩张程度的检测 | 第104-106页 |
| 4.3.2 重组菌株的发酵与产酶检测 | 第106页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第106-109页 |
| 4.4.1 高表达植酸酶对内质网扩张的影响 | 第106-107页 |
| 4.4.2 共表达HAC1i对内质网扩张的影响 | 第107-108页 |
| 4.4.3 植酸酶表达量与内质网扩张程度的关系 | 第108-109页 |
| 4.5 本章小结 | 第109-111页 |
| 第五章 高表达植酸酶重组菌株核糖体相对水平的调控 | 第111-124页 |
| 5.1 引言 | 第111页 |
| 5.2 材料与设备 | 第111-113页 |
| 5.2.1 质粒、菌株与引物 | 第111-112页 |
| 5.2.2 主要仪器与设备 | 第112页 |
| 5.2.3 主要试剂 | 第112页 |
| 5.2.4 主要培养基与溶液的配制 | 第112-113页 |
| 5.3 实验方法 | 第113-114页 |
| 5.3.1 敲除WSC1重组菌株的构建 | 第113页 |
| 5.3.2 重组菌株的发酵与产酶检测 | 第113-114页 |
| 5.3.3 rRNA相对水平的检测 | 第114页 |
| 5.3.4 重组菌株内质网扩张程度的检测 | 第114页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第114-122页 |
| 5.4.1 共表达HAC1i对核糖体相对水平的影响 | 第114-115页 |
| 5.4.2 Wsc1p对高效表达重组蛋白时核糖体相对水平的调控 | 第115-121页 |
| 5.4.3 高效表达重组蛋白时细胞维护内质网稳态的模型 | 第121-122页 |
| 5.5 本章小结 | 第122-124页 |
| 结论与展望 | 第124-128页 |
| 结论 | 第124页 |
| 本论文创新点 | 第124-126页 |
| 展望 | 第126-128页 |
| 参考文献 | 第128-154页 |
| 附录 | 第154-163页 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 | 第163-165页 |
| 致谢 | 第165-166页 |
| 附件 | 第166页 |
