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N-乙酰神经氨酸特异性生物传感器的构建及生产菌株优化

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N-乙酰神经氨酸特异性生物传感器的构建及生产菌株优化
论文目录
 
摘要第1-11页
ABSTRACT第11-15页
缩略词表(ABBREVIATION)第15-17页
第一章 绪论第17-51页
  1.1 N-乙酰神经氨酸概述第17-18页
  1.2 NeuAc的合成与降解第18-23页
    1.2.1 NeuAc的合成途径第18-22页
    1.2.2 NeuAc的降解途径第22-23页
  1.3 NeuAc的生产第23-30页
    1.3.1 天然产物提取法第23-24页
    1.3.2 化学合成法第24-25页
    1.3.3 酶法合成第25-27页
    1.3.4 全细胞生物催化第27-29页
    1.3.5 微生物发酵法第29-30页
  1.4 不同来源酶的筛选第30-34页
    1.4.1 NeuAc醛缩酶第30-31页
    1.4.2 GlcNAc 2-异构酶第31-32页
    1.4.3 NeuAc合成酶第32-34页
  1.5 生物传感器概述第34-36页
  1.6 基于转录因子的传感器第36-43页
    1.6.1 TF传感器用于酶的筛选第36-37页
    1.6.2 TF传感器用于代谢工程第37-41页
    1.6.3 TF传感器设计第41-43页
  1.7 基于RNA的传感器第43-49页
    1.7.1 RNA传感器的设计第43-48页
    1.7.2 RNA传感器的应用第48-49页
  1.8 本论文的研究内容及意义第49-51页
第二章 理性设计优化N-乙酰神经氨酸生产菌株第51-79页
  2.1 实验材料第51-59页
    2.1.1 菌株和质粒第51-55页
    2.1.2 培养基和主要试剂第55-57页
      2.1.2.1 培养基第55-56页
      2.1.2.2 主要试剂和缓冲液第56-57页
    2.1.3 分子生物学常用酶第57页
    2.1.4 常用试剂盒第57页
    2.1.5 常用生化试剂第57-58页
    2.1.6 仪器和设备第58-59页
  2.2 实验方法第59-66页
    2.2.1 菌种保藏第59页
    2.2.2 PCR扩增第59-60页
    2.2.3 CaCl_2法制备感受态细胞第60页
    2.2.4 CaCl_2法制备的感受态细胞转化第60-61页
    2.2.5 酶切连接构建质粒pB第61-62页
    2.2.6 pAglk的构建第62页
    2.2.7 pBglnA的构建第62页
    2.2.8 pIn-T7P整合质粒的构建第62-63页
    2.2.9 电转化法敲除大肠杆菌基因第63-64页
      2.2.9.1 电转化感受态细胞的制备第63页
      2.2.9.2 敲除片段的获得第63-64页
      2.2.9.3 电转化第64页
      2.2.9.4 阳性克隆的筛选和重组质粒的去除第64页
      2.2.9.5 抗性基因的去除第64页
    2.2.10 重组大肠杆菌发酵生产NeuAc第64-65页
    2.2.11 检测方法第65-66页
      2.3.11.1 发酵过程中糖浓度的测定第65页
      2.2.11.2 细菌生长情况检测第65页
      2.2.11.3 副产物的检测第65页
      2.2.11.4 NeuAc的检测第65-66页
  2.3 实验结果第66-77页
    2.3.1 间苯二酚法测定NeuAc的标准曲线第66页
    2.3.2 NeuAc生产菌株DN5/pNnsGM限制性因素分析第66-70页
    2.3.3 构建NeuAc合酶催化的合成途径第70-72页
    2.3.4 菌株PEP代谢途径改造第72-74页
    2.3.5 提高NeuAc生产的其它尝试第74-75页
    2.3.6 1L发酵罐条件优化第75-77页
  2.4 本章小结第77-79页
第三章 N-乙酰神经氨酸生物传感器的构建及菌株进化第79-107页
  3.1 实验材料及方法第79-93页
    3.1.1 菌株和质粒第79-84页
    3.1.2 培养基和试剂第84-85页
    3.1.3 质粒构建第85-88页
      3.1.3.1 pS-gfp的构建第85-86页
      3.1.3.2 pS-tetA的构建第86页
      3.1.3.3 p-gfp和p-tetA的构建第86页
      3.1.3.4 pE-rs-gusA的构建第86页
      3.1.3.5 pSA和pSB的构建第86-87页
      3.1.3.6 RBS突变体文库的构建第87页
      3.1.3.7 NeuB突变体文库的构建第87-88页
      3.1.3.8 NeuB突变体的pET28a表达质粒构建第88页
    3.1.4 培养条件第88-90页
      3.1.4.1 以sfgfp为报告基因的功能验证第88页
      3.1.4.2 以tetA为报告基因的功能验证第88-89页
      3.1.4.3 NeuAc传感器在植物乳杆菌中的功能验证第89页
      3.1.4.4 模拟筛选第89页
      3.1.4.5 RBS文库及突变体酶的筛选第89-90页
      3.1.4.6 双阶段发酵第90页
    3.1.5 蛋白表达及分离纯化第90-91页
      3.1.5.1 菌体培养第90页
      3.1.5.2 蛋白纯化第90-91页
    3.1.6 SDS电泳凝胶配制及蛋白检测第91-92页
      3.1.6.1 相关试剂第91-92页
      3.1.6.2 Glycine-SDS-PAGE胶配制第92页
      3.1.6.3 蛋白检测第92页
    3.1.7 荧光测定及胞内NeuAc定量第92-93页
    3.1.8 蛋白质含量的测定第93页
    3.1.9 NeuB酶活测定第93页
  3.2 实验结果第93-105页
    3.2.1 构建NeuAc响应的核糖开关第93-97页
    3.2.2 模拟筛选验证传感器的可用性第97-99页
    3.2.3 基于传感器的NeuAc代谢途径优化第99-103页
    3.2.4 基于传感器的NeuAc合酶进化第103-105页
  3.3 本章小结第105-107页
创新性成果与展望第107-108页
创新性成果第107页
展望第107-108页
参考文献第108-125页
致谢第125-127页
攻读学位期间发表的学术论文第127-128页
外文写作第128-129页
学位论文评阅及答辩情况表第129页

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