论文目录 | |
| 摘要 | 第1-6页 |
| abstract | 第6-14页 |
| 中英文缩略词表 | 第14-15页 |
| 前言 | 第15-18页 |
| 第1章 肾细胞癌组织中CSN5的表达及其与临床病理特点之间的关系 | 第18-36页 |
| 引言 | 第18-19页 |
| 材料和方法 | 第19-31页 |
| 1.材料 | 第19-24页 |
| 1.1 临床标本 | 第19页 |
| 1.2 试剂 | 第19页 |
| 1.3 实验室自配试剂 | 第19-23页 |
| 1.4 实验用的主要设备 | 第23-24页 |
| 2.提取RNA及实时荧光定量PCR | 第24-27页 |
| 2.1 提取RNA | 第24-25页 |
| 2.2 反转录合成cDNA | 第25-26页 |
| 2.3 实时荧光定量PCR | 第26-27页 |
| 3.蛋白免疫印迹反应 | 第27-29页 |
| 3.1 样本总蛋白的提取 | 第27页 |
| 3.2 测量总蛋白样品的浓度 | 第27页 |
| 3.3 电泳 | 第27-28页 |
| 3.4 转膜 | 第28页 |
| 3.5 免疫反应 | 第28-29页 |
| 3.6 曝光并分析结果 | 第29页 |
| 4.免疫组织化学检测CSN5的表达 | 第29-31页 |
| 4.1 采用Envision免疫组化法,按如下步骤进行实验 | 第29-30页 |
| 4.2 读取结果 | 第30-31页 |
| 5.统计学方法 | 第31页 |
| 结果 | 第31-34页 |
| 1.检测CSN5在肾癌组织及癌旁组织中的表达 | 第31-33页 |
| 2.回顾性分析随访患者的临床病理特征,并分析其与CSN5表达的关系 | 第33-34页 |
| 讨论 | 第34-35页 |
| 结论 | 第35-36页 |
| 第2章 CSN5通过增加ZEB1表达促进肾癌细胞的转移和EMT | 第36-80页 |
| 引言 | 第36-38页 |
| 第一节 通过体内、外实验证明降低CSN5的表达后会抑制肾癌细胞的转移侵袭能力 | 第38-58页 |
| 1.材料 | 第38-43页 |
| 1.1 实验细胞与动物 | 第38页 |
| 1.2 实验材料 | 第38-39页 |
| 1.3 自配实验室试剂 | 第39-42页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第42-43页 |
| 2.细胞培养 | 第43-44页 |
| 2.1 复苏细胞 | 第43页 |
| 2.2 细胞传代 | 第43-44页 |
| 2.3 细胞冻存 | 第44页 |
| 2.4 转染肾癌细胞(Lipofectamine2000法) | 第44页 |
| 3.shCSN5质粒的构建 | 第44-50页 |
| 3.1 shCSN5质粒的对应靶序列 | 第44-45页 |
| 3.2 构建干扰质粒 | 第45-49页 |
| 3.3 无内毒素质粒大提 | 第49-50页 |
| 4.稳定转染肾癌细胞系的建立 | 第50-51页 |
| 5.Transwell检测CSN5对ACHN细胞侵袭和迁移能力的影响 | 第51-52页 |
| 5.1 细胞侵袭实验 | 第51页 |
| 5.2 细胞迁移实验 | 第51-52页 |
| 6.动物实验 | 第52-54页 |
| 6.1 实验设计原则 | 第52页 |
| 6.2 准备细胞 | 第52页 |
| 6.3 动物模型的建立 | 第52-54页 |
| 7.统计学分析 | 第54页 |
| 结果 | 第54-58页 |
| 1.肾癌细胞株和正常肾小管上皮细胞株中CSN5的表达情况 | 第54页 |
| 2.最佳CSN5稳转干扰质粒的筛选 | 第54-55页 |
| 3.通过体外实验研究沉默CSN5后肾癌细胞转移侵袭能力的变化 | 第55-56页 |
| 4.通过体内实验研究沉默CSN5后肾癌细胞转移侵袭能力的变化 | 第56-58页 |
| 第二节 CSN5通过增加ZEB1表达促进RCC细胞的转移和EMT | 第58-77页 |
| 材料与方法 | 第58-73页 |
| 1.材料 | 第58-62页 |
| 1.1 临床标本 | 第58页 |
| 1.2 实验材料 | 第58-59页 |
| 1.3 自配试剂 | 第59-61页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第61-62页 |
| 2.构建Flagtagged-pcDNA3.1(+)-CSN5重组质粒 | 第62-69页 |
| 2.1 Flagtagged-pcDNA3.1(+)-CSN5构建的引物 | 第62-63页 |
| 2.2 细胞总RNA的提取 | 第63-64页 |
| 2.3 逆转录RNA成cDNA | 第64-65页 |
| 2.4 PCR扩增 | 第65-66页 |
| 2.5 PCR产物胶的回收 | 第66-67页 |
| 2.6 双酶切及连接反应 | 第67页 |
| 2.7 感受态细胞的制备 | 第67-68页 |
| 2.8 质粒小提 | 第68-69页 |
| 2.9 鉴定CSN5真核表达质粒的鉴定 | 第69页 |
| 3.构建Flagtagged-pcDNA3.1(+)-ZEB1重组质粒 | 第69-71页 |
| 3.1 pcDNA3.1-3xFlag-ZEB1质粒构建引物的设计 | 第70页 |
| 3.2 细胞总RNA的提取 | 第70页 |
| 3.3 RNA逆转录成cDNA | 第70页 |
| 3.4 PCR扩增 | 第70页 |
| 3.5 PCR产物胶的回收 | 第70页 |
| 3.6 双酶切及连接反应 | 第70页 |
| 3.7 感受态细胞的制备 | 第70-71页 |
| 3.8 质粒小提 | 第71页 |
| 3.9 鉴定ZEB1真核表达质粒 | 第71页 |
| 4.稳定转染肾癌细胞系的建立 | 第71页 |
| 5.RNA的提取及聚合酶链反应(PCR) | 第71-72页 |
| 5.1 RNA提取 | 第71-72页 |
| 5.2 逆转录合成cDNA | 第72页 |
| 5.3 qRT-PCR | 第72页 |
| 6.免疫荧光染色 | 第72-73页 |
| 7.统计学分析 | 第73页 |
| 结果 | 第73-77页 |
| 1.转染过表达质粒后细胞蛋白表达的检测 | 第73-74页 |
| 2.改变肾癌细胞中CSN5的表达,观察EMT相关蛋白的表达 | 第74-75页 |
| 3.检测CSN5与ZEB1蛋白表达之间的关系 | 第75页 |
| 4.检测CSN5与ZEB1mRNA表达之间的关系 | 第75-76页 |
| 5.ZEB1在CSN5介导的肾癌细胞转移侵袭有重要作用 | 第76-77页 |
| 讨论 | 第77-79页 |
| 结论 | 第79-80页 |
| 第3章 CSN5调控ZEB1表达的机制研究 | 第80-91页 |
| 引言 | 第80-81页 |
| 材料和方法 | 第81-86页 |
| 1.材料 | 第81-83页 |
| 2.蛋白质免疫共沉淀(CO-IP) | 第83-85页 |
| 3.免疫荧光染色 | 第85页 |
| 4.统计学分析 | 第85-86页 |
| 结果 | 第86-88页 |
| 1.检测内源性CSN5和ZEB1是结合在一起 | 第86-87页 |
| 2.检测CSN5是通过泛素化酶系统调控ZEB | 第87-88页 |
| 讨论 | 第88-90页 |
| 结论 | 第90-91页 |
| 全文总结 | 第91-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-99页 |
| 攻读学位期间的研究成果及荣誉 | 第99-100页 |
| 综述 CSN5的研究进展 | 第100-107页 |
| 参考文献 | 第104-107页 |
