论文目录 | |
论文创新点 | 第1-9页 |
摘要 | 第9-11页 |
Abstract | 第11-13页 |
1 引言 | 第13-39页 |
1.1 VSV的病毒学属性 | 第13-14页 |
1.2 VSV的致病机理及临床症状 | 第14-15页 |
1.3 VSV的病毒粒子的形态及结构 | 第15-19页 |
1.3.1 VSV的病毒粒子结构 | 第15-16页 |
1.3.2 VSV编码的病毒蛋白及功能 | 第16-19页 |
1.4 VSV的复制周期 | 第19-21页 |
1.5 VSV基因的转录 | 第21-28页 |
1.5.1 VSV基因的转录是有顺序的 | 第21-22页 |
1.5.2 VSV基因的转录是有极性的 | 第22页 |
1.5.3 VSV mRNA特殊的加帽机制 | 第22页 |
1.5.4 VSV的转录起始位点 | 第22-25页 |
1.5.5 转录的顺式作用元件 | 第25-27页 |
1.5.6 VSV基因转录的终止序列 | 第27-28页 |
1.6 VSV基因组的复制 | 第28-29页 |
1.7 VSV RNA的合成与包涵体的形成 | 第29-31页 |
1.7.1 细胞中VSV RNA合成的定位 | 第29-30页 |
1.7.2 微管依赖的RNA运输 | 第30页 |
1.7.3 包涵体的形成 | 第30-31页 |
1.8 VSV的微基因组复制子 | 第31-34页 |
1.8.1 DI颗粒 | 第31-32页 |
1.8.2 编码病毒结构蛋白的微基因组复制子 | 第32-33页 |
1.8.3 编码氯霉素乙酰转移酶的微基因组复制子 | 第33-34页 |
1.9 反向遗传学与重组水泡性口炎病毒 | 第34-37页 |
1.9.1 反向遗传学系统 | 第34-36页 |
1.9.2 重组VSV的获得 | 第36-37页 |
1.10 VSV在医学上的应用 | 第37-39页 |
1.10.1 VSV作为疫苗载体 | 第37页 |
1.10.2 VSV作为溶瘤病毒 | 第37-39页 |
1.10.3 VSV作为治疗用病毒的优势 | 第39页 |
1.11 本论文的研究计划 | 第39页 |
2 实验材料与方法 | 第39-55页 |
2.1 实验材料 | 第39-43页 |
2.1.1 实验仪器 | 第39-40页 |
2.1.2 实验试剂及耗材 | 第40-43页 |
2.2 分子生物学实验技术 | 第43-50页 |
2.2.1 质粒提取 | 第43-44页 |
2.2.2 聚合酶链式反应(PCR) | 第44-45页 |
2.2.3 限制性内切酶反应 | 第45页 |
2.2.4 DNA回收 | 第45-46页 |
2.2.5 DNA片段与载体连接反应 | 第46页 |
2.2.6 质粒及DNA连接产物转化 | 第46页 |
2.2.7 哺乳动物细胞RNA的抽提 | 第46-47页 |
2.2.8 逆转录 | 第47页 |
2.2.9 基因定点突变 | 第47-48页 |
2.2.10 荧光定量PCR | 第48页 |
2.2.11 蛋白免疫印迹 | 第48-50页 |
2.2.12 GST pulldown | 第50页 |
2.3 酵母双杂交实验 | 第50-51页 |
2.4 细胞实验技术 | 第51-55页 |
2.4.1 细胞传代培养 | 第51页 |
2.4.2 细胞冻存与复苏 | 第51-52页 |
2.4.3 细胞转染 | 第52页 |
2.4.4 CAT酶联免疫吸附测定 | 第52-53页 |
2.4.5 免疫共沉淀 | 第53页 |
2.4.6 氯化铯密度梯度离心 | 第53-54页 |
2.4.7 重组VSV病毒的包装 | 第54-55页 |
3 实验结果 | 第55-77页 |
3.1 N蛋白氨基端的氨基酸在病毒复制转录中起着重要作用 | 第55-69页 |
3.1.1 实验设计 | 第55-56页 |
3.1.2 N蛋白氨基端点突变对CAT报告基因表达的影响 | 第56-57页 |
3.1.3 N蛋白氨基端的氨基酸对于CATminigenome的复制转录都非常重要 | 第57-59页 |
3.1.4 N_(4-6A3),N_(7-9A3),N_(13-15A3)和N_(R7A)这几个突变体保持了N-N,N-P间的相互作用 | 第59-60页 |
3.1.5 N_(4-6A3),N_(7-9A3),N_(13-15A3)和N_(R7A)保持特异性结合病毒基因组RNA的能力 | 第60-62页 |
3.1.6 N_(4-6A3),N_(7-9A3),N_(13-15A3)和N_(R7A)不能保护基因组RNA免受核酶的消化 | 第62-63页 |
3.1.7 N_(4-6A3),N_(7-9A3),N_(13-15A3)和N_(R7A)不能有效地形成包涵体 | 第63-65页 |
3.1.8 N_(4-6A3),N_(7-9A3),N_(13-15A3)在minigenome报告系统中有Dominantnegative的效应 | 第65-66页 |
3.1.9 基因组的N基因上带有点突变的重组VSV的包装 | 第66-67页 |
3.1.10 从结构上分析N蛋白氨基端的臂在N-RNA复合体中的重要作用 | 第67-69页 |
3.2 P蛋白氨基端60,62,64位氨基酸在病毒转录复制中的重要作用 | 第69-77页 |
3.2.1 实验设计 | 第69-70页 |
3.2.2 P3A不能支持VSV minigenome的复制与转录 | 第70-71页 |
3.2.3 P3A仍然能够寡聚化 | 第71-73页 |
3.2.4 P3A依然可以与N,L相互作用 | 第73页 |
3.2.5 P蛋白氨基端磷酸化的缺失不影响其在细胞中的定位 | 第73-74页 |
3.2.6 P3A无法指导N蛋白特异性识别病毒基因组RNA | 第74-77页 |
4 讨论与展望 | 第77-82页 |
4.1 N蛋白上的关键氨基酸突变后对病毒复制转录的影响 | 第77-79页 |
4.2 P蛋白氨基端磷酸化缺失对病毒复制转录的影响 | 第79-81页 |
4.3 总结 | 第81-82页 |
5 参考文献 | 第82-88页 |
攻博期间发表的科研成果目录 | 第88-89页 |
致谢 | 第89页 |