论文目录 | |
| 致谢 | 第1-7页 |
| 前言 | 第7-9页 |
| 中文摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 缩略词表 | 第13-20页 |
| 引言 | 第20-22页 |
| 第一部分 miR-22调控血管平滑肌细胞收缩基因表达及功能 | 第22-65页 |
| 1 材料 | 第22-26页 |
| 1.1 实验动物 | 第22页 |
| 1.2 细胞培养所需有关试剂 | 第22页 |
| 1.3 其他试剂及缓冲液 | 第22-24页 |
| 1.4 常用仪器及耗材 | 第24-25页 |
| 1.5 统计分析及引物设计软件 | 第25-26页 |
| 2 方法 | 第26-42页 |
| 2.1 小鼠原代血管平滑肌细胞培养 | 第26-27页 |
| 2.2 血管原代平滑肌细胞传代 | 第27页 |
| 2.3 人动脉平滑肌培养 | 第27页 |
| 2.4 血管平滑肌细胞表型转化研究模型 | 第27-29页 |
| 2.4.1 血管导丝拉伤模型 | 第28页 |
| 2.4.2 主动脉组织的离体培养模型 | 第28页 |
| 2.4.3 自然表型转化的模型 | 第28页 |
| 2.4.4 各种病理生理因素刺激模型 | 第28-29页 |
| 2.5 荧光素酶报告实验 | 第29-30页 |
| 2.6 平滑肌细胞中miRNA-22的过表达和抑制 | 第30-31页 |
| 2.7 引物设计 | 第31-34页 |
| 2.8 血管平滑肌细胞中总RNA (Total RNA)提取 | 第34页 |
| 2.9 miRNA cDNA的逆转录合成与实时荧光定量PCR(RT-qPCR) | 第34-36页 |
| 2.10 普通mRNA的cDNA逆转录合成与实时荧光定量PCR(RT-qPCR) | 第36-38页 |
| 2.11 血管平滑肌细胞增殖实验 | 第38-39页 |
| 2.12 平滑肌细胞迁移实验 | 第39-40页 |
| 2.13 平滑肌细胞凋亡实验 | 第40-41页 |
| 2.14 统计分析 | 第41-42页 |
| 3 结果 | 第42-63页 |
| 3.1 成功分离血管原代平滑肌细胞并培养 | 第42-43页 |
| 3.2 miR-22在血管损伤后明显下降 | 第43页 |
| 3.3 主动脉组织的离体培养(ex-vivo)模型中miR-22及血管平滑肌收缩基因表达显著降低 | 第43-44页 |
| 3.4 血管平滑肌细胞自然表型转化的模型中miR-22及血管平滑肌收缩基因表达逐渐降低 | 第44-45页 |
| 3.5 血管平滑肌细胞中miR-22在高浓度FBS、PDGF-BB刺激下显著下降 | 第45页 |
| 3.6 血管平滑肌细胞中的miR-22在TGF-β刺激下显著上升 | 第45-46页 |
| 3.7 miR-22在平滑肌细胞表型转化过程中受转录调控 | 第46-47页 |
| 3.8 miR-22调控特异性平滑肌收缩基因表达 | 第47-49页 |
| 3.9 miR-22调控血管平滑肌细胞增殖 | 第49-52页 |
| 3.10 miR-22调控血管平滑肌细胞迁移 | 第52-59页 |
| 3.11 miR-22调控人动脉平滑肌细胞特异性收缩基因表达及增殖、迁移功能改变 | 第59-62页 |
| 3.12 miR-22不影响血管平滑肌细胞凋亡 | 第62-63页 |
| 4 讨论 | 第63-65页 |
| 第二部分 miR-22通过调控EVI-1/MECP-2影响平滑肌细胞表型转化 | 第65-101页 |
| 1 材料 | 第65-69页 |
| 1.1 细胞培养试剂 | 第65页 |
| 1.2 分子生物学常用试剂及缓冲液 | 第65-67页 |
| 1.3 常用仪器及耗材 | 第67页 |
| 1.4 统计分析软件及靶基因预测网站 | 第67-69页 |
| 2 方法 | 第69-82页 |
| 2.1 预测并筛选miR-22靶基因 | 第69页 |
| 2.2 EVI-1 3'UTR荧光素酶报告基因的构建 | 第69-74页 |
| 2.3 靶基因EVI-1 3'UTR上miR-22结合位点突变 | 第74-75页 |
| 2.4 EVI-1基因稳定敲低细胞系的建立 | 第75-76页 |
| 2.5 荧光素酶报告实验和β-gal活性检测 | 第76-77页 |
| 2.6 Western Blot蛋白检测 | 第77-79页 |
| 2.7 平滑肌细胞MECP-2 siRNA转染 | 第79页 |
| 2.8 EVI-1基因稳定敲低细胞系中转染miR-22抑制剂 | 第79页 |
| 2.9 血管平滑肌细胞功能实验 | 第79-80页 |
| 2.10 染色质免疫沉淀技术(CHIP) | 第80-81页 |
| 2.11 分析方法 | 第81-82页 |
| 3 结果 | 第82-99页 |
| 3.1 生物信息学预测及RT-PCR结果显示EVI-1/MECP-2是miR-22的靶基因 | 第82-83页 |
| 3.2 miR-22调控血管平滑肌细胞中MECP-2表达 | 第83-84页 |
| 3.3 抑制MECP-2能起到类似于过表达miR-22的功能-升高血管平滑肌细胞收缩基因表达并抑制其增殖及迁移功能 | 第84-87页 |
| 3.4 miR-22调控血管平滑肌细胞中EVI-1表达 | 第87-88页 |
| 3.5 miR-22通过直接结合EVI-1 3'UTR上的结合位点下调EVI-1表达 | 第88-89页 |
| 3.6 成功建立EVI-1基因稳定敲低细胞系 | 第89-90页 |
| 3.7 抑制EVI-1能起到类似于过表达miR-22的功能-升高血管平滑肌细胞收缩基因表达并抑制其增殖及迁移功能 | 第90-92页 |
| 3.8 EVI-1介导miR-22调控血管平滑肌细胞收缩基因表达及增殖、迁移功能改变 | 第92-96页 |
| 3.9 EVI-I直接作用于血管平滑肌细胞收缩基因及其转录因子 | 第96-97页 |
| 3.10 EV1-1影响血管平滑肌细胞收缩基因及其转录因子启动子区域的甲基化水平 | 第97-99页 |
| 4 讨论 | 第99-101页 |
| 第三部分 miR-22对导丝拉伤所导致的血管内膜新生的影响 | 第101-120页 |
| 1 材料 | 第101-104页 |
| 1.1 实验动物 | 第101页 |
| 1.2 动物实验手术器械 | 第101页 |
| 1.3 常用试剂及缓冲液 | 第101-102页 |
| 1.4 常用仪器及耗材 | 第102-103页 |
| 1.5 统计分析软件 | 第103-104页 |
| 2 方法 | 第104-109页 |
| 2.1 小鼠股动脉导丝拉伤模型 | 第104-105页 |
| 2.2 小鼠股动脉高表达miR-22干预血管损伤 | 第105页 |
| 2.3 小鼠血管组织RNA提取及检测 | 第105-106页 |
| 2.4 小鼠血管取材及石蜡包埋切片 | 第106页 |
| 2.5 血管石蜡切片HE染色分析 | 第106-107页 |
| 2.6 血管石蜡切片免疫染色 | 第107-108页 |
| 2.7 统计分析 | 第108-109页 |
| 3 结果 | 第109-118页 |
| 3.1 成功建立小鼠股动脉血管损伤模型 | 第109-110页 |
| 3.2 血管损伤后miR-22表达明显降低 | 第110页 |
| 3.3 血管过表达miR-22明显抑制导丝损伤导致的内膜新生 | 第110-112页 |
| 3.4 过表达miR-22升高平滑肌细胞收缩性基因的表达 | 第112-113页 |
| 3.5 过表达miR-22抑制在体平滑肌细胞增殖 | 第113-115页 |
| 3.6 miR-22通过调控MECP-2/EVI-1的表达抑制导丝拉伤所导致的血管内膜新生 | 第115-118页 |
| 4 讨论 | 第118-120页 |
| 第四部分 miR-22及其靶基因在人正常和病变血管中的表达差异 | 第120-125页 |
| 1 材料 | 第120-121页 |
| 1.1 人体正常及病变血管标本 | 第120页 |
| 1.2 人体标本收集实验手术器械 | 第120页 |
| 1.3 常用试剂及缓冲液 | 第120页 |
| 1.4 常用仪器及耗材 | 第120页 |
| 1.5 统计分析相关软件 | 第120-121页 |
| 2 方法 | 第121-122页 |
| 2.1 人体血管组织RNA提取及检测 | 第121页 |
| 2.2 人体血管组织取材及石蜡包埋切片 | 第121页 |
| 2.3 血管石蜡切片HE染色分析 | 第121页 |
| 2.4 统计分析 | 第121-122页 |
| 3 结果 | 第122-124页 |
| 3.1 与健康血管相比病变血管有明显的病变形成 | 第122页 |
| 3.2 病变血管的miR-22明显降低,而其靶基因MECP-2和EVI-1明显上升,两者之间存在明显的负相关 | 第122-124页 |
| 4 讨论 | 第124-125页 |
| 总结与展望 | 第125-127页 |
| 结论 | 第127-128页 |
| 参考文献 | 第128-132页 |
| 综述 微小核糖核酸（microRNA)调控血管平滑肌细胞表型转化参与血管损伤修复的研究进展 | 第132-160页 |
| 参考文献 | 第150-160页 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 | 第160-162页 |
