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钩端螺旋体蛋白酶体功能及作用机制研究

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分类:教育论文网→医学卫生论文→基础医学论文医学微生物学(病原细菌学、病原微生物学)论文螺旋体属论文
钩端螺旋体蛋白酶体功能及作用机制研究
论文目录
 
致谢第1-6页
中文摘要第6-8页
Abstract第8-10页
英文缩写词表第10-18页
第一章 引言第18-26页
  1.1 钩端螺旋体第18页
  1.2 钩端螺旋体病第18-19页
  1.3 AAA+蛋白酶/蛋白酶体第19-22页
    1.3.1 真核细胞型生物蛋白酶体第19-20页
    1.3.2 原核细胞型微生物蛋白酶体第20页
    1.3.3 细菌蛋白酶体HslUV(ClpYQ)第20-22页
  1.4 本论文研究内容与目的第22-24页
    1.4.1 研究内容第22-24页
    1.4.2 研究目的第24页
  1.5 本论文研究方案与技术路线第24-25页
  1.6 本论文创新之处第25-26页
第二章 问号钩体蛋白酶体基因的克隆与原核表达第26-53页
  2.1 前言第26-27页
  2.2 材料与方法第27-47页
    2.2.1 主要仪器、试剂及实验材料第27-30页
    2.2.2 主要溶液及培养基配置第30-32页
    2.2.3 问号钩体蛋白酶体生物信息学分析第32-33页
    2.2.4 问号钩体基因组DNA提取第33-34页
    2.2.5 问号钩体蛋白酶体基因扩增与纯化第34-36页
      2.2.5.1 PCR体系及条件第34页
      2.2.5.2 PCR扩增片段的纯化第34-36页
    2.2.6 问号钩体蛋白酶体基因的T-A克隆第36-38页
      2.2.6.1 感受态细胞的制备第36页
      2.2.6.2 DNA片段与克隆载体的连接第36页
      2.2.6.3 连接产物的转化第36-37页
      2.2.6.4 质粒的提取第37-38页
      2.2.6.5 酶切鉴定与测序第38页
    2.2.7 问号钩体蛋白酶体基因原核表达系统的构建第38-40页
      2.2.7.1 各目标基因片段的获取与纯化第38-39页
      2.2.7.2 重组质粒的构建和转化第39-40页
      2.2.7.3 重组质粒的提取、酶切鉴定与测序第40页
    2.2.8 clpA基因的克隆与表达(基于Gateway技术)第40页
    2.2.9 重组蛋白的诱导表达第40-41页
    2.2.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳第41-42页
    2.2.11 重组蛋白的纯化第42-43页
    2.2.12 兔抗血清制备及Western Blot检测第43-44页
    2.2.13 ELISA法测定抗血清效价第44-45页
    2.2.14 免疫沉淀法提取钩体天然蛋白nHslU和nHslV第45-47页
  2.3 实验结果第47-52页
    2.3.1 问号钩体蛋白酶体的生物信息学分析第47-48页
      2.3.1.1 问号钩体蛋白酶体氨基酸序列分析第47页
      2.3.1.2 问号钩体蛋白酶体结构预测与分析第47-48页
    2.3.2 问号钩体蛋白酶体基因PCR扩增结果第48页
    2.3.3 问号钩体蛋白酶体基因T-A克隆鉴定结果第48-49页
    2.3.4 问号钩体蛋白酶体基因亚克隆双酶切鉴定结果第49-50页
    2.3.5 ClpX/ClpP/ClpS/ClpA的重组表达和提纯结果第50页
    2.3.6 HslU/HslV的重组表达和提纯结果第50-52页
    2.3.7 问号钩体蛋白酶体各亚基的抗血清制备第52页
  2.4 小结第52-53页
第三章 问号钩体蛋白酶体HslUV酶学性质研究第53-69页
  3.1 前言第53-54页
  3.2 材料与方法第54-61页
    3.2.1 主要仪器及试剂第54-55页
    3.2.2 主要溶液与试剂配置第55-56页
    3.2.3 Western Blot法检测目标蛋白第56页
    3.2.4 rHslUV酶活性测定第56页
    3.2.5 标准曲线绘制第56-58页
    3.2.6 酶动力学参数测定第58-59页
    3.2.7 rHslUV酶活性阻断实验第59-60页
    3.2.8 统计学分析方法第60-61页
  3.3 实验结果第61-68页
    3.3.1 问号钩体hslUV操纵子分析第61页
    3.3.2 问号钩体HslU/HslV功能结构域分析第61-62页
    3.3.3 hslU/hslV基因在不同血清群血清型问号钩体中的分布与表达情况第62-63页
    3.3.4 问号钩体rHslU和rHslV不同摩尔配比后的酶活性变化的比较结果第63-65页
    3.3.5 问号钩体rHslUV具有蛋白酶体糜蛋白酶样酶活性第65页
    3.3.6 蛋白酶体抑制剂对问号钩体rHslUV酶活性具有阻断作用第65-66页
    3.3.7 标准曲线绘制第66-67页
    3.3.8 问号钩体rHslUV酶动力学参数第67-68页
  3.4 小结第68-69页
第四章 感染细胞前后问号钩体hslU和hslV基因表达差异的检测第69-77页
  4.1 前言第69页
  4.2 材料与方法第69-75页
    4.2.1 主要仪器及试剂第69-70页
    4.2.2 实验菌株与细胞株第70页
    4.2.3 问号钩体感染细胞模型第70-71页
    4.2.4 问号钩体的收集第71页
    4.2.5 问号钩体RNA提取第71-72页
    4.2.6 RNA的定量与反转录第72-73页
    4.2.7 实时荧光定量PCR第73-74页
    4.2.8 Western Blot法检测目标蛋白第74页
    4.2.9 统计学分析方法第74-75页
  4.3 实验结果与小结第75-77页
    4.3.1 RT-qPCR引物序列及相应熔解曲线和扩增效率分析第75页
    4.3.2 感染细胞前后问号钩体蛋白酶体基因表达差异的检测第75-77页
第五章 问号钩体蛋白酶体基因缺失突变株的构建及鉴定第77-90页
  5.1 前言第77页
  5.2 材料与方法第77-86页
    5.2.1 主要仪器及试剂第77-78页
    5.2.2 钩体的培养第78-79页
    5.2.3 自杀质粒的构建第79-81页
    5.2.4 钩体基因敲除突变体的筛选与鉴定第81-86页
  5.3 钩体基因敲除突变体的鉴定结果第86-89页
    5.3.1 钩体基因敲除突变体的筛选第86-87页
    5.3.2 钩体基因敲除突变体的鉴定第87页
    5.3.3 钩体C△hslUV基因敲除突变体的筛选与鉴定第87-89页
  5.4 小结第89-90页
第六章 感染细胞前后不同问号钩体胞内变性蛋白变化水平检测第90-96页
  6.1 前言第90-91页
  6.2 材料与方法第91-94页
    6.2.1 主要仪器及试剂第91-92页
    6.2.2 问号钩体及细胞株的培养第92页
    6.2.3 问号钩体感染细胞模型第92-93页
    6.2.4 问号钩体的收集第93页
    6.2.5 问号钩体胞内变性蛋白检测第93-94页
  6.3 实验结果第94-95页
    6.3.1 不同问号钩体胞内变性蛋白的检测第94-95页
  6.4 小结第95-96页
第七章 感染宿主后不同问号钩体活力和致病力比较第96-107页
  7.1 前言第96页
  7.2 材料与方法第96-100页
    7.2.1 主要仪器、试剂及耗材第96页
    7.2.2 问号钩体、细胞株及实验动物第96-97页
    7.2.3 问号钩体的收集第97页
    7.2.4 问号钩体感染细胞模型第97页
    7.2.5 有关钩体活力与荧光强度关系的标准曲线绘制第97-98页
    7.2.6 荧光分光光度计法检测钩体活力第98页
    7.2.7 激光共聚焦显微镜法检测钩体活力第98页
    7.2.8 不同钩体感染J774A.1细胞后生长情况分析第98-99页
    7.2.9 问号钩体感染动物模型第99页
    7.2.10 动物组织病理学检查及组织中钩体载量检测第99页
    7.2.11 动物血液和尿液中钩体数量检测第99-100页
  7.3 实验结果第100-106页
    7.3.1 不同钩体感染J774A.1细胞后钩体活力检测第100-101页
    7.3.2 不同钩体感染J774A.1细胞后钩体生长情况检测第101-102页
    7.3.3 不同钩体的LD_(50)值测定第102-103页
    7.3.4 不同钩体对金地鼠肺、肝、肾组织的病理学损伤情况第103页
    7.3.5 感染不同钩体后金地鼠肺、肝、肾、血液及尿液中钩体载量情况第103-106页
  7.4 小结第106-107页
第八章 感染细胞前后不同问号钩体胞内变性蛋白的提取及鉴定第107-118页
  8.1 前言第107-108页
  8.2 材料与方法第108-115页
    8.2.1 主要仪器及试剂第108-109页
    8.2.2 问号钩体及细胞株的培养第109页
    8.2.3 问号钩体感染细胞模型第109-110页
    8.2.4 问号钩体的收集第110页
    8.2.5 问号钩体胞内变性蛋白的提取第110-111页
    8.2.6 蛋白定量(Bradford法)第111页
    8.2.7 蛋白酶解(Filter Aided Sample Preparation,FASP)第111-112页
    8.2.8 iTRAQ标记第112页
    8.2.9 酶解肽段离线预分离及LC-MS/MS质谱分析第112-113页
    8.2.10 质谱数据分析第113-114页
    8.2.11 数据的生物信息解析(功能分析)第114-115页
  8.3 实验结果第115-117页
    8.3.1 钩体变性蛋白鉴定结果第115页
    8.3.2 钩体变性蛋白聚类分析第115-116页
    8.3.3 钩体变性蛋白KEGG和GO富集分析第116-117页
  8.4 小结第117-118页
结果与讨论第118-121页
参考文献第121-130页
综述第130-151页
References第141-151页
附录一第151-153页
附录二第153-156页
附录三第156-163页
作者简历与攻读学位期间取得的科研成果第163页

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