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DCAF13在小鼠早期胚胎发育中的调节机制研究

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DCAF13在小鼠早期胚胎发育中的调节机制研究
论文目录
 
致谢第1-7页
中文摘要第7-8页
Abstract第8-10页
缩略词表第10-18页
第一章 绪论第18-39页
  1.1 CRL4泛素连接酶第18-25页
    1.1.1 Cullin-RING E3泛素连接酶(CRLs)第18-20页
    1.1.2 CRL4 E3泛素连接酶的结构组成第20-21页
    1.1.3 DDB1-CUL4相关因子第21-23页
    1.1.4 CRL4的参与调节染色质动态变化第23-25页
  1.2 线虫是一种传统的模式动物第25-31页
    1.2.1 C.elegans被发展成模式动物的几个优点第25-29页
    1.2.2 线虫的生殖系统发育过程第29-31页
  1.3 TALEN制作基因敲除小鼠第31-34页
    1.3.1 TALEN的结构原理第31-32页
    1.3.2 TALEN质粒的组装及制作敲除小鼠第32-34页
  1.4 早期胚胎发育中的染色质重构第34-39页
    1.4.1 小鼠早期胚胎发育过程第34-36页
    1.4.2 早期胚胎发育过程中的染色质结构动态变化第36-37页
    1.4.3 早期胚胎发育过程中的组蛋白修饰变化第37-39页
第二章 材料与方法第39-69页
  2.1 实验仪器及耗材第39-41页
    2.1.1 实验仪器第39-40页
    2.1.2 实验耗材第40-41页
  2.2 实验材料第41-46页
    2.2.1 实验动物第41-42页
    2.2.2 实验细胞系第42-43页
    2.2.3 常用试剂第43-46页
  2.3 常用缓冲液配方第46-55页
    2.3.1 C.elegans相关缓冲液第46-47页
    2.3.2 分子克隆相关缓冲液第47-48页
    2.3.3 蛋白免疫印迹缓冲液第48-52页
    2.3.4 免疫荧光缓冲液第52-53页
    2.3.5 小鼠基因型鉴定相关缓冲液第53-55页
  2.4 实验方法步骤第55-69页
    2.4.1 利用TALEN技术制作Dcaf13敲除小鼠第55-56页
    2.4.2 小鼠基因型鉴定第56-58页
    2.4.3 卵母细胞和早期胚胎的收集及其体外培养第58-59页
    2.4.4 RNA显微注射第59页
    2.4.5 免疫荧光实验第59-60页
    2.4.6 质粒构建第60-62页
    2.4.7 实时定量PCR第62-64页
    2.4.8 质粒或siRNA转染第64页
    2.4.9 流式细胞仪检测细胞周期第64页
    2.4.10 MTT细胞增殖能力检测第64-65页
    2.4.11 克隆形成实验第65页
    2.4.12 蛋白质免疫共沉淀第65页
    2.4.13 体内泛素化检测第65-66页
    2.4.14 Western blot第66-67页
    2.4.15 单胚胎RNA-seq第67-69页
第三章 实验结果与分析第69-107页
  3.1 线虫RNAi结果显示zk430.7调节生殖发育第69-73页
    3.1.1 线虫feeding RNAi的筛选目录及过程第69-70页
    3.1.2 线虫RNAi结果发现CRL4在调节生殖发育中起重要作用第70-71页
    3.1.3 Dcaf13是一个进化极其保守的基因第71-73页
    3.1.4 小结与讨论第73页
  3.2 DCAF13是一个位于细胞核及核仁的DCAF第73-78页
    3.2.1 DCAF13的WD40结构域与DDB1相互作用第73-74页
    3.2.2 过表达的DCAF13定位于细胞核及核仁第74-75页
    3.2.3 414 RRRKEMNRRK423是DCAF13的核仁定位序列第75-76页
    3.2.4 内源DCAF13是一个细胞核及核仁蛋白第76-78页
    3.2.5 小结与讨论第78页
  3.3 Dcaf13敲除早期胚胎植入前致死第78-83页
    3.3.1 Dcaf13敲除小鼠的构建及鉴定第78-80页
    3.3.2 基因型鉴定发现Dcaf13敲除早期胚胎植入前致死第80-81页
    3.3.3 免疫荧光染色发现Dcaf13敲除早期胚胎植入前致死第81-82页
    3.3.4 小结与讨论第82-83页
  3.4 DCAF13在植入前早期胚胎发育中逐渐表达第83-85页
    3.4.1 Dcaf13 mRNA在早期胚胎发育中高表达第83-84页
    3.4.2 DCAF13蛋白在小鼠植入前早期胚胎发育中逐渐累积第84-85页
    3.4.3 小结与讨论第85页
  3.5 Dcaf13 RNA干扰后胚胎H3K9me3及SUV39H1升高第85-88页
    3.5.1 Dcaf13 RNA干扰后胚胎表型同敲除Dcaf13一致第85-87页
    3.5.2 Dcaf13 RNA干扰后胚胎H3K9me3及SUV39H1升高第87-88页
    3.5.3 小结与讨论第88页
  3.6 细胞系中RNA干扰Dcaf13使细胞核异染色质化第88-93页
    3.6.1 在HeLa细胞中RNA干扰Dcaf13使细胞形态变圆、细胞核皱缩第88-90页
    3.6.2 RNA干扰Dcaf13后的HeLa细胞没有发生明显凋亡第90-92页
    3.6.3 RNA干扰Dcaf13后H3K9me3及HP1升高第92-93页
    3.6.4 小结与讨论第93页
  3.7 细胞系中SUV39H1被CRL4~(DCAF13)多聚泛素化第93-97页
    3.7.1 SUV39H1能够直接与DDB1和DCAF13相互作用第93-94页
    3.7.2 SUV39H1的多聚泛素化被DDB1和DCAF13影响第94-95页
    3.7.3 SUV39H1的K78、K121、K138被CRL4~(DCAF13)多聚泛素化第95-96页
    3.7.4 过表达DCAF13后SUV39H1量减少第96页
    3.7.5 小结与讨论第96-97页
  3.8 过表达SUV39H1与敲除Dcaf13表型类似第97-102页
    3.8.1 构建出SUV39H1催化活性丧失的突变质粒第97-98页
    3.8.2 过表达SUV39H1后胚胎发育率显著降低第98-99页
    3.8.3 mCherry-SUV39H1在早期胚胎发育中逐渐被降解第99-100页
    3.8.4 过表达SUV39H1的胚胎中H3K9me3及HP1升高第100-101页
    3.8.5 小结与讨论第101-102页
  3.9 Dcaf13 RNA干扰的胚胎谱系决定的基因表达明显降低第102-107页
    3.9.1 Dcaf13 RNAi后Cdx2与Nanog的mRNA表达显著降低第102-103页
    3.9.2 Dcaf13 RNAi后CDX2与NANOG蛋白表达显著降低第103-104页
    3.9.3 Dcaf13 RNA干扰后没有显著影响OCT4的蛋白水平第104-105页
    3.9.4 小结与讨论第105-107页
第四章 总结讨论第107-111页
  4.1 总结第107-108页
  4.2 讨论第108-111页
第五章 文献综述第111-119页
参考文献第119-131页
附录第131-135页
作者简历第135-136页

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