论文目录 | |
| 论文创新点 | 第1-6页 |
| 中文摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-14页 |
| 引言 | 第14页 |
| 第一部分 研究背景 | 第14-50页 |
| 第一章 EV71简介 | 第14-32页 |
| 1.1 EV71的流行病毒学 | 第14-15页 |
| 1.2 EV71的分子病毒学 | 第15-24页 |
| 1.2.1 EV71的理化特征 | 第15-16页 |
| 1.2.2 EV71的基因组 | 第16-18页 |
| 1.2.3 EV71的生活周期 | 第18-24页 |
| 1.3 EV71的感染及发病机理 | 第24-27页 |
| 1.3.1 EV71的传播途径 | 第24-25页 |
| 1.3.2 EV71相关的病症机理 | 第25-27页 |
| 1.4 EV71的预防及治疗 | 第27-32页 |
| 1.4.1 EV71传播的监管和隔离措施 | 第27页 |
| 1.4.2 EV71疫苗的开发 | 第27-28页 |
| 1.4.3 EV71抗病毒药物的开发 | 第28-32页 |
| 第二章 PCBP1蛋白简介 | 第32-39页 |
| 2.1 PCBP1的发现和定义 | 第32-33页 |
| 2.2 PCBP1的结构 | 第33-34页 |
| 2.3 PCBP1的定位 | 第34页 |
| 2.4 PCBP1的功能 | 第34-39页 |
| 2.4.1 转录激活 | 第34-35页 |
| 2.4.2 衰减选择性剪接调节 | 第35页 |
| 2.4.3 mRNA稳定 | 第35-36页 |
| 2.4.4 翻译调节 | 第36页 |
| 2.4.5 促进肿瘤发生和癌症进程 | 第36-37页 |
| 2.4.6 铁转运和储存 | 第37-39页 |
| 第三章 宿主蛋白与RNA病毒复制的关系 | 第39-50页 |
| 3.1 特异性IRES反式转录因子(ITAFs) | 第39-41页 |
| 3.1.1 hnRNP A1 | 第39-40页 |
| 3.1.2 FBP1和FBP2 | 第40页 |
| 3.1.3 hnRNP K | 第40-41页 |
| 3.2 其他宿主蛋白 | 第41-44页 |
| 3.2.1 RTN3 | 第41-42页 |
| 3.2.2 CstF-64 | 第42-44页 |
| 3.3 病毒复制复合体 | 第44-50页 |
| 3.3.1 结构 | 第44-47页 |
| 3.3.2 功能 | 第47-48页 |
| 3.3.3 重排过程 | 第48-50页 |
| 第二部分 研究内容 | 第50-91页 |
| 第四章 PCBP1与EV715'UTR RNA特异性结合的研究 | 第50-62页 |
| 4.1 引言 | 第50页 |
| 4.2 实验材料及仪器 | 第50-52页 |
| 4.2.0 细胞 | 第50页 |
| 4.2.1 病毒 | 第50-51页 |
| 4.2.2 引物 | 第51页 |
| 4.2.3 工具酶 | 第51页 |
| 4.2.4 生物试剂 | 第51页 |
| 4.2.5 化学试剂及仪器 | 第51-52页 |
| 4.3 实验方法 | 第52-57页 |
| 4.3.1 哺乳动物细胞培养 | 第52-53页 |
| 4.3.2 病毒扩增及滴度测定 | 第53-54页 |
| 4.3.3 Trizol法提取细胞总RNA | 第54-55页 |
| 4.3.4 免疫沉淀及RT-PCR | 第55-56页 |
| 4.4.5 RNA体外转录 | 第56页 |
| 4.4.6 非变性凝胶迁移试验(Native gel mobility shift assay) | 第56-57页 |
| 4.4.7 生物素标记RNA pull-down | 第57页 |
| 4.4 实验结果和讨论 | 第57-62页 |
| 4.4.1 PCBP1蛋白在体外能特异性结合EV71 5'UTR | 第57-59页 |
| 4.4.2 PCBP1蛋白在细胞水平特异性结合EV71 5'UTR | 第59-62页 |
| 第五章 PCBP1与EV71 5'UTR结合结构域的分析 | 第62-71页 |
| 5.1 引言 | 第62页 |
| 5.2 实验材料和仪器 | 第62-64页 |
| 5.2.1 细胞和菌株 | 第62-63页 |
| 5.2.3 引物 | 第63页 |
| 5.2.4 工具酶 | 第63页 |
| 5.2.5 生物试剂 | 第63页 |
| 5.2.6 化学试剂及实验仪器 | 第63-64页 |
| 5.3 实验方法 | 第64-68页 |
| 5.3.1 高纯度质粒提取(以Qiagen试剂盒为例) | 第64-65页 |
| 5.3.2 DNA目的片段回收(以Axygen试剂盒为例) | 第65页 |
| 5.3.3 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第65页 |
| 5.3.4 大肠杆菌常规转化方法(Yc法) | 第65-66页 |
| 5.3.5 哺乳动物细胞转染 | 第66页 |
| 5.3.6 蛋白质免疫印迹(Western Blot) | 第66-68页 |
| 5.4 实验结果和讨论 | 第68-71页 |
| 5.4.1 PCBP1结合在EV71 5'UTR的茎环结构Ⅰ和Ⅳ区域 | 第68-69页 |
| 5.4.2 PCBP1的KH1结构域参与EV71 5'UTR的结合 | 第69-71页 |
| 第六章 EV71对PCBP1亚细胞定位的影响 | 第71-76页 |
| 6.1 引言 | 第71页 |
| 6.2 实验材料和仪器 | 第71-72页 |
| 6.2.1 细胞 | 第71页 |
| 6.2.2 EV71病毒感染 | 第71页 |
| 6.2.3 生物试剂 | 第71-72页 |
| 6.2.4 化学试剂及实验仪器 | 第72页 |
| 6.3 实验方法 | 第72-73页 |
| 6.3.1 免疫荧光 | 第72-73页 |
| 6.3.2 细胞核蛋白抽提 | 第73页 |
| 6.3.3 其他实验方法 | 第73页 |
| 6.4 实验结果和讨论 | 第73-76页 |
| 6.4.1 EV71感染引起PCBP1在细胞质中的重分布 | 第73-75页 |
| 6.4.2 EV71感染增加PCBP1在细胞质中分布 | 第75-76页 |
| 第七章 PCBP1定位于内质网膜相关EV71病毒复制复合体 | 第76-80页 |
| 7.1 引言 | 第76页 |
| 7.2 实验材料及仪器 | 第76-77页 |
| 7.2.1 细胞和病毒感染 | 第76页 |
| 7.2.2 生物试剂 | 第76页 |
| 7.2.3 实验材料及仪器 | 第76-77页 |
| 7.3 实验方法 | 第77-78页 |
| 7.3.1 免疫荧光 | 第77页 |
| 7.3.2 膜分离及溶解试验(Membrane flotation and detergent solubilizationassays) | 第77页 |
| 7.3.3 Western blot | 第77-78页 |
| 7.4 实验结果和讨论 | 第78-80页 |
| 7.4.1 PCBP1,内质网来源膜结构和病毒RNA的共定位 | 第78-79页 |
| 7.4.2 PCBP1定位于EV71病毒复制膜复合体 | 第79-80页 |
| 第八章 PCBP1蛋白促进EV71病毒蛋白翻译和病毒产量 | 第80-86页 |
| 8.1 引言 | 第80页 |
| 8.2 实验材料和仪器 | 第80页 |
| 8.2.1 细胞和病毒 | 第80页 |
| 8.2.2 生物试剂及仪器 | 第80页 |
| 8.3 实验方法 | 第80-82页 |
| 8.3.1 哺乳动物细胞瞬时转染 | 第80-81页 |
| 8.3.2 免疫印迹 | 第81页 |
| 8.3.3 MTT法测定细胞活性实验 | 第81页 |
| 8.3.4 TCID50法测定病毒滴度 | 第81页 |
| 8.3.5 统计学分析 | 第81-82页 |
| 8.4 实验结果和讨论 | 第82-86页 |
| 8.4.1 PCBP1蛋白在真核细胞中的表达效率 | 第82-83页 |
| 8.4.2 PCBP1促进EV71病毒蛋白的翻译 | 第83-84页 |
| 8.4.3 PCBP1促进EV71子代病毒的产量 | 第84-86页 |
| 第九章 PCBP1从翻译和RNA复制水平促进EV71复制 | 第86-91页 |
| 9.1 引言 | 第86页 |
| 9.2 实验材料和仪器 | 第86-87页 |
| 9.2.1 细胞和病毒 | 第86页 |
| 9.2.2 质粒 | 第86页 |
| 9.2.3 引物 | 第86-87页 |
| 9.2.4 生物试剂 | 第87页 |
| 9.2.5 实验仪器 | 第87页 |
| 9.3 实验方法 | 第87-88页 |
| 9.3.1 哺乳动物细胞的转染(见第五章) | 第87页 |
| 9.3.2 荧光素酶报告基因检测 | 第87-88页 |
| 9.3.3 Trizol法提取细胞内RNA(见第四章) | 第88页 |
| 9.3.4 Real-time RT-PCR检测病毒+/-链RNA | 第88页 |
| 9.4 实验结果和讨论 | 第88-91页 |
| 9.4.1 PCBP1增强EV71 IRES的翻译活性 | 第88-89页 |
| 9.4.2 PCBP1增强EV71 RNA的合成 | 第89-91页 |
| 总论 | 第91-94页 |
| 附表I 本研究中涉及的引物序列信息 | 第94-96页 |
| 附表II 常用试剂配方 | 第96-97页 |
| 参考文献 | 第97-113页 |
| 攻博期间发表和待发表的论文 | 第113-114页 |
| 致谢 | 第114页 |
