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利用人工接头和UL12.5蛋白研究内质网—线粒体复合体和线粒体DNA在神经退化中的作用

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利用人工接头和UL12.5蛋白研究内质网—线粒体复合体和线粒体DNA在神经退化中的作用
论文目录
 
摘要第1-7页
ABSTRACT第7-13页
第1章 绪论第13-25页
  1.1 引言第13页
  1.2 线粒体与神经退化第13-15页
  1.3 线粒体DNA与神经退化第15-18页
  1.4 线粒体动态与CMT2A疾病第18-21页
  1.5 神经退化中内质网的重塑第21页
  1.6 神经退化诱导模型第21-23页
  1.7 iPSCs诱导和神经分化技术第23-25页
第2章 实验方法与实验步骤第25-46页
  2.1 质粒构建第25-26页
    2.1.1 细胞器标记质粒的构建第25页
    2.1.2 内质网-线粒体接头载体的构建第25页
    2.1.3 运动神经元标记质粒第25-26页
  2.2 CMT2A,ADOA病人iPSCs的诱导第26-34页
    2.2.1 CMT2A病人皮肤细胞,ADOA病人尿液细胞的获得和培养第26-27页
    2.2.2 原代细胞的支原体检测与冻存第27页
    2.2.3 iPSCs诱导的相关准备工作第27-28页
    2.2.4 iPSCs的诱导第28-31页
    2.2.5 iPSCs克隆的挑取,培养与冻存第31-32页
    2.2.6 iPSCs细胞的鉴定第32-34页
  2.3 iPSCs的神经分化第34-36页
    2.3.1 人神经前体细胞与神经元的诱导第34-35页
    2.3.2 人神经元的随机分化第35页
    2.3.3 运动神经元分化第35-36页
  2.4 神经退化模型第36-38页
    2.4.1 体内神经退化模型(臂丛神经截断术)第36-37页
    2.4.2 体外神经退化(激光突出切断)第37页
    2.4.3 神经退化的检测第37-38页
  2.5 线粒体相关检测第38-42页
    2.5.1 神经元线粒体相关标记第38页
    2.5.2 线粒体长度的测量第38-39页
    2.5.3 线粒体电势的测量第39页
    2.5.4 线粒体Ca~(2+)浓度的测量第39-40页
    2.5.5 线粒体mPTP的测量第40页
    2.5.6 线粒体运动的测量第40-41页
    2.5.7 线粒体和内质网的三维重构第41页
    2.5.8 电镜检测第41-42页
  2.6 ROS检测第42页
  2.7 神经元代谢检测第42-43页
    2.7.1 胞内总ATP水平的检测第42页
    2.7.2 seahorse的检测第42-43页
  2.8 神经元膜片钳检测第43-44页
  2.9 动物行为学实验第44-46页
    2.9.1 转棒实验:第44页
    2.9.2 水迷宫实验:第44-45页
    2.9.3 旷场实验:第45页
    2.9.4 悬尾实验:第45-46页
第3章 实验结果与实验数据第46-113页
  3.1 MFN2R94Q和ADOAiPSCs诱导和功能检测第46-56页
    3.1.1 CMT2A病人皮肤成纤维细胞和ADOA病人尿液细胞可以诱导成为诱导多能干细胞第46-48页
    3.1.2 MFN2R94Q iPSCs具有多能性第48-50页
    3.1.3 MFN2R94Q iPSCs线粒体功能的检测第50-55页
    3.1.4 MFN2R94Q iPSCs具有正常ROS水平和细胞周期第55-56页
  3.2 MFN2R94Q iPSCs来源的神经元中出现内质网和线粒体的偶联第56-71页
    3.2.1 MFN2R94Q iPSCs可以分化成为神经干细胞第56-58页
    3.2.2 MFN2R94Q神经干细胞中MFN1,OPA1表达水平下降,ROS水平增加第58-61页
    3.2.3 MFN2R94Q神经干细胞可以分化成为多种神经元和胶质细胞第61-63页
    3.2.4 MFN2R94Q神经元线粒体相关功能的检测第63-67页
    3.2.5 MFN2R94Q神经元胞体ROS水平异常升高第67页
    3.2.6 MFN2R94Q神经元中片段化内质网和线粒体的关系第67-69页
    3.2.7 MFN2R94Q神经元出现突出退化第69-71页
  3.3 体外突出切断或polybrene诱导神经退化模型中出现内质网-线粒体复合体第71-81页
    3.3.1 突出切断或polybrene诱导神经退化中出现线粒体-内质网复合体第71-74页
    3.3.2 退化的神经元中内质网-线粒体复合体第74-76页
    3.3.3 内质网-线粒体复合体也出现在体内神经退化模型中第76-77页
    3.3.4 退化神经元中线粒体功能异常第77-80页
    3.3.5 polybrene诱导神经元中胞体ROS水平升高第80-81页
  3.4 神经退化和内质网片段化具有线粒体电势依赖性第81-84页
    3.4.1 降低线粒体的电势能抑制突出切断或polybrene诱导的线粒体Ca~(2+)浓度的异常升高第81-82页
    3.4.2 降低线粒体的电势能抑制突出切断或polybrene诱导的神经退化现象第82-83页
    3.4.3 降低线粒体的电势能抑制突出切断或polybrene诱导的突出内质网的片段化第83-84页
  3.5 利用人工内质网-线粒体接头研究内质网-线粒体复合体在神经退化中的作用第84-93页
    3.5.1 OMM-ER接头能改变内质网的形态,模拟内质网和线粒体复合体第84-86页
    3.5.2 表达OMM-FP-ER接头蛋白的同时促进内质网Ca~(2+)释放能导致神经突出退化的发生第86-88页
    3.5.3 表达OMM-ER接头蛋白的同时促进内质网Ca~(2+)释放导致线粒体功能异常第88-92页
    3.5.4 表达OMM-ER接头蛋白的同时促进内质网Ca~(2+)释放导致神经元ROS水平的增加第92-93页
  3.6 体外研究线粒体DNA在神经元中的作用第93-109页
    3.6.1 表达UL12.5可以降解神经元细胞mtDNA第94-96页
    3.6.2 mtDNA对神经元基因转录水平的影响第96-97页
    3.6.3 mtDNA对胞质Ca~(2+)浓度的影响第97页
    3.6.4 mtDNA对神经元线粒体功能的影响第97-104页
    3.6.5 mtDNA对神经元代谢的影响第104-106页
    3.6.6 mtDNA对神经元电生理的影响第106-107页
    3.6.7 卡路里限制导致mtDNA缺失神经元退化和凋亡第107-109页
  3.7 体内研究卡路里限制对mtDNA突变小鼠的影响第109-113页
    3.7.1 卡路里限制对POLG突变小鼠运动耐受的影响第109-110页
    3.7.2 卡路里限制对POLG突变小鼠学习记忆的影响第110-111页
    3.7.3 卡路里限制对POLG突变小鼠焦虑和抑郁的影响第111-113页
第4章 讨论第113-117页
参考文献第117-132页
附录一 实验材料与试剂第132-134页
附录二 试验中所用到的各种培养基的配方第134-135页
附录三 实验中使用的引物序列与抗体第135-138页
致谢第138-139页
在读期间取得的科研成果第139页

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