论文目录 | |
| 中文摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-12页 |
| 缩略语/符号说明 | 第12-13页 |
| 前言 | 第13-20页 |
| 研究现状、成果 | 第13-18页 |
| 研究目的、方法 | 第18-20页 |
| 一、PDGFC新型剪接体在增殖性糖尿病视网膜病变纤维增殖膜中的表达 | 第20-24页 |
| 1.1 对象和方法 | 第20-21页 |
| 1.1.1 增殖性糖尿病视网膜病病人的选取 | 第20页 |
| 1.1.2 增殖性糖尿病视网膜病纤维增殖膜的收集 | 第20页 |
| 1.1.3 增殖性糖尿病视网膜病纤维增殖膜的总RNA提取 | 第20页 |
| 1.1.4 总RNA的逆转录 | 第20-21页 |
| 1.1.5 常规PCR | 第21页 |
| 1.1.6 琼脂糖凝胶电泳 | 第21页 |
| 1.2 结果 | 第21-22页 |
| 1.2.1 琼脂糖凝胶检测各标本总RNA的完整性 | 第21-22页 |
| 1.2.2 常规PCR检测PDGFC在增殖性糖尿病视网膜病变纤维增殖膜中的表达 | 第22页 |
| 1.3 讨论 | 第22-23页 |
| 1.3.1 PDGFC PCR产物的多样性 | 第22-23页 |
| 1.4 小结 | 第23-24页 |
| 二、PDGFC新型剪接体的克隆和表达质粒的构建 | 第24-36页 |
| 2.1 对象和方法 | 第24-28页 |
| 2.1.1 PDGFC PCR产物的克隆 | 第24页 |
| 2.1.2 PDGFC PCR产物克隆的扩增 | 第24页 |
| 2.1.3 PDGFC PCR产物阳性克隆的筛选 | 第24页 |
| 2.1.4 PCR筛选的琼脂糖凝胶电泳 | 第24页 |
| 2.1.5 PDGFC阳性克隆的质粒提取 | 第24-25页 |
| 2.1.6 PDGFC阳性克隆的测序 | 第25页 |
| 2.1.7 PDGFC阳性克隆测序结果比对 | 第25页 |
| 2.1.8 新型PDGFC剪接体的开放读码框架(Open Reading Frame,ORF)分析 | 第25页 |
| 2.1.9 根据新型PDGFC剪接体的ORF,设计带FLAG标签的表达引物 | 第25页 |
| 2.1.10 用表达引物和高保真PCR扩增新型剪接体 | 第25-26页 |
| 2.1.11 琼脂糖凝胶电泳 | 第26页 |
| 2.1.12 PDGFC_1、PDGFC_2和PDGFC_(full)克隆到TOPO载体中 | 第26页 |
| 2.1.13 PDGFC_1、PDGFC_2和PDGFC_(full)克隆的扩增 | 第26页 |
| 2.1.14 PDGFC_1、PDGFC_2和PDGFC_(full)阳性克隆的筛选 | 第26页 |
| 2.1.15 PCR筛选的琼脂糖凝胶电泳 | 第26页 |
| 2.1.16 PDGFC_1、PDGFC_2和PDGFC_(full)阳性克隆的质粒提取 | 第26页 |
| 2.1.17 酶切鉴定PDGFC_1、PDGFC_2和PDGFC_(full)阳性克隆并纯化插入片段 | 第26-27页 |
| 2.1.18 pcDNA载体的线性化和线性化载体的纯化 | 第27页 |
| 2.1.19 琼脂糖凝胶电泳比较插入片段和线性化载体的相对浓度 | 第27页 |
| 2.1.20 将PDGFC_1、PDGFC_2和PDGFC_(full)片段连接入pc-DNA表达载体 | 第27页 |
| 2.1.21 与pcDNA载体连接产物的转化和扩增 | 第27-28页 |
| 2.1.22 表达载体阳性克隆的筛选 | 第28页 |
| 2.1.23 阳性克隆的酶切验证 | 第28页 |
| 2.2 结果 | 第28-35页 |
| 2.2.1 PDGFC的多种PCR产物克隆入TOPO载体的筛选结果 | 第28-29页 |
| 2.2.2 阳性克隆序列比对结果 | 第29页 |
| 2.2.3 新型剪接体PDGFC1和PDGFC2的ORF分析以及表达引物的设计 | 第29-33页 |
| 2.2.4 用表达引物扩增的PCR产物 | 第33页 |
| 2.2.5 表达引物扩增后的PCR产物克隆入TOPO载体 | 第33-34页 |
| 2.2.6 表达引物扩增后的PDGFC_1,PDGFC_2和PDGFC_(full)亚克隆入pcDNA表达载体 | 第34-35页 |
| 2.2.7 PDGFC_1,PDGFC_2和PDGFC_(full)克隆入pcDNA表达载体后的酶切鉴定 | 第35页 |
| 2.3 讨论 | 第35页 |
| 2.3.1 PDGFC_1和PDGFC_2为PDGFC新型剪接体的确定 | 第35页 |
| 2.4 小结 | 第35-36页 |
| 三、PDGFC新型剪接体在视网膜微血管内皮细胞中的表达和功能 | 第36-45页 |
| 3.1 对象和方法 | 第36-38页 |
| 3.1.1 猴视网膜微血管内皮细胞RF/6A的培养 | 第36页 |
| 3.1.2 去内毒素提取要转染的质粒 | 第36页 |
| 3.1.3 PDGFC_1-pcDNA,PDGFC_2-pcDNA和PDGFC_(full)-pcDNA转染乏RF/6A细胞 | 第36页 |
| 3.1.4 用共转染表达绿色荧光蛋白质粒的方法估算转染效率 | 第36-37页 |
| 3.1.5 基因组实时PCR检测检测细胞的转染效率 | 第37页 |
| 3.1.6 免疫荧光检测转染后外源蛋白在RF/6A细胞中的表达 | 第37页 |
| 3.1.7 检测转染新型剪接体后RF/6A细胞的数量变化 | 第37-38页 |
| 3.1.8 实时PCR检测转染后细胞内总PDGFC的表达变化 | 第38页 |
| 3.2 结果 | 第38-43页 |
| 3.2.1 共转染绿色荧光蛋白估算转染效率 | 第38-39页 |
| 3.2.2 基因组实时PCR检测转染效率 | 第39-40页 |
| 3.2.3 免疫荧光检测转染后新型剪接体的表达 | 第40-41页 |
| 3.2.4 过表达新型剪接体对视网膜血管内皮细胞数量的影响 | 第41-42页 |
| 3.2.5 过表达新型剪接体抑制视网膜血管内皮细胞增殖的可能机制 | 第42-43页 |
| 3.3 讨论 | 第43-44页 |
| 3.4 小结 | 第44-45页 |
| 全文结论 | 第45-46页 |
| 论文创新点 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-51页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第51-52页 |
| 综述 营养因子在糖尿病视网膜病变中的作用 | 第52-60页 |
| 参考文献 | 第57-60页 |
| 致谢 | 第60页 |
