论文目录 | |
| 摘要 | 第1-7页 |
| abstract | 第7-19页 |
| 第一部分 引言 | 第19-28页 |
| 1.1 糖尿病的基本概况 | 第19-20页 |
| 1.2 T2D与基因突变 | 第20-23页 |
| 1.2.1 单基因T2D | 第21-23页 |
| 1.2.2 多基因T2D | 第23页 |
| 1.3 PEPBs蛋白的概述 | 第23-24页 |
| 1.4 PEPB4蛋白与肿瘤 | 第24-25页 |
| 1.5 PEPB4蛋白对细胞功能的调控机制 | 第25-26页 |
| 1.6 本研究的由来与思路 | 第26-28页 |
| 第二部分 糖尿病家族谱系中的PEBP4基因突变 | 第28-32页 |
| 2.1 病例对象与研究方法 | 第28-29页 |
| 2.1.1 先证者基本情况 | 第28页 |
| 2.1.2 家系资料收集 | 第28-29页 |
| 2.1.3 检测方法 | 第29页 |
| 2.2 结果 | 第29-30页 |
| 2.2.1 家系成员临床检测结果 | 第29-30页 |
| 2.2.2 家系四位成员全基因组外显子测序结果 | 第30页 |
| 2.3 讨论 | 第30-32页 |
| 第三部分 PEBP4—— 一种分泌型蛋白 | 第32-54页 |
| 3.1 材料 | 第32-36页 |
| 3.1.1 实验细胞 | 第32-33页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第33-35页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第35-36页 |
| 3.2 方法 | 第36-47页 |
| 3.2.1 用生物信息学方法探讨PEBP4基因序列的特点 | 第36页 |
| 3.2.2 扩增PEBP4基因 | 第36-38页 |
| 3.2.3 构建C’-Myc-PEBP4质粒 | 第38-41页 |
| 3.2.4 人源胚胎肾细胞HEK293T的培养 | 第41-43页 |
| 3.2.5 用磷酸钙沉淀法将C’-Myc-PEBP4质粒转染HEK293T细胞 | 第43页 |
| 3.2.6 C’-Myc-PEBP4质粒在HEK293T细胞表达之鉴定 | 第43-47页 |
| 3.3 结果 | 第47-52页 |
| 3.3.1 用生物信息学方法确认PEBP4是一个分泌型蛋白 | 第47-50页 |
| 3.3.2 成功扩增m PEBP4-Full length基因 | 第50页 |
| 3.3.3 C’-Myc-PEBP4重组质粒测序鉴定结果 | 第50-51页 |
| 3.3.4 C’-/N’-Myc融合后PEBP4在 293T细胞内定位之改变 | 第51页 |
| 3.3.5 C’-/N’-Myc融合后PEBP4在 293T细胞浆/培养液之表达改变 | 第51-52页 |
| 3.4 讨论 | 第52-54页 |
| 第四部分 PEBP-4 的糖基化 | 第54-70页 |
| 4.1 材料 | 第55-58页 |
| 4.1.1 实验细胞 | 第55页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第55-57页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第57-58页 |
| 4.2 方法 | 第58-63页 |
| 4.2.1 用生物信息学方法探讨PEBP4基因序列的糖基化位点 | 第58-59页 |
| 4.2.2 扩增PEBP4-R172/-T172A/-E188基因 | 第59-60页 |
| 4.2.3 构建C’-Myc His PEBP4-R172质粒 | 第60页 |
| 4.2.4 C’-Myc His PEBP4-R172质粒转染入HEK293T细胞系 | 第60页 |
| 4.2.5 HEK293T-C’-Myc His-R172细胞浆/培养液中PEBP4的表达 | 第60-61页 |
| 4.2.6 蛋白质组学方法探讨h PEBP4/m PEBP4糖基化 | 第61-63页 |
| 4.2.7 N-glycans分析 | 第63页 |
| 4.3 结果 | 第63-67页 |
| 4.3.1 用生物信息学方法确认PEBP4基因序列的糖基化位点 | 第63页 |
| 4.3.2 成功扩增C’-Myc His PEBP4-R172、C’-Myc His PEBP4-T172A、C’-Myc His PEBP4-E188质粒 | 第63-64页 |
| 4.3.3 T171A突变型与野生型h PEBP4的表达差异 | 第64-65页 |
| 4.3.4 h PEBP4和m PEBP4样本的SDS- PAGE电泳 | 第65页 |
| 4.3.5 HILIC LC/MS分析野生型h PEBP4的糖基化 | 第65页 |
| 4.3.6 LC-MS/MS分析野生型h PEBP4的糖基化4.3.6 LC-MS/MS分析野生型m PEBP4的糖基化 | 第65-67页 |
| 4.4 讨论 | 第67-70页 |
| 第五部分 PEBP4与MAPK-ERK/Akt信号通路 | 第70-86页 |
| 5.1 材料 | 第71-74页 |
| 5.1.1 实验细胞 | 第71页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第71-73页 |
| 5.1.3 主要仪器 | 第73-74页 |
| 5.2 方法 | 第74-81页 |
| 5.2.1 构建p SUPER-PEBP4环状DNA质粒 | 第74-77页 |
| 5.2.2 转化反应 | 第77-78页 |
| 5.2.3 人源胚胎肾细胞HEK293T的培养 | 第78页 |
| 5.2.4 PEB4在EGF介导下对细胞内ERK和磷酸化ERK的影响 | 第78-79页 |
| 5.2.5 PEB4在EGF介导下对细胞内AKT和磷酸化AKT的影响 | 第79-81页 |
| 5.3 结果 | 第81-84页 |
| 5.3.1 成功扩增sh PEBP4基因片段 | 第81页 |
| 5.3.2 p SUPER-PEBP4重组质粒测序鉴定正确 | 第81-82页 |
| 5.3.3 沉默PEBP4对EGF处理细胞ERK1/2 表达的影响 | 第82页 |
| 5.3.4 转染N’末端或C’末端对ERK1/2 表达的影响 | 第82-83页 |
| 5.3.5 转染N’末端或C’末端对EGF处理细胞ERK1/2 表达的影响 | 第83页 |
| 5.3.6 沉默PEBP4对EGF处理细胞AKT表达的影响 | 第83-84页 |
| 5.3.7 转染N’末端或C’末端对AKT表达的影响 | 第84页 |
| 5.4 讨论 | 第84-86页 |
| 第六部分 敲除PEBP4后雌性小鼠代谢的若干改变 | 第86-97页 |
| 6.1 材料 | 第86-88页 |
| 6.1.1 实验动物 | 第86-87页 |
| 6.1.2 主要试剂 | 第87页 |
| 6.1.3 主要仪器 | 第87-88页 |
| 6.2 方法 | 第88-91页 |
| 6.2.1 F0代敲除PEBP4基因小鼠的获得 | 第88页 |
| 6.2.2 敲除PEBP4基因小鼠的DNA鉴定 | 第88-90页 |
| 6.2.3 敲除PEBP4基因小鼠纯合子的获得 | 第90页 |
| 6.2.4 敲除PEBP4基因雌性小鼠若干代谢生理指标的监测 | 第90-91页 |
| 6.3 结果 | 第91-95页 |
| 6.3.1 F0代敲除基因小鼠的PCR鉴定结果 | 第91页 |
| 6.3.2 F1代敲除基因小鼠的PCR鉴定结果 | 第91-92页 |
| 6.3.3 F2代敲除基因小鼠的PCR鉴定结果 | 第92页 |
| 6.3.4 敲除基因雌性小鼠体形改变的观察 | 第92-93页 |
| 6.3.5 敲除基因雌性小鼠体重改变的检测 | 第93-94页 |
| 6.3.6 敲除基因雌性小鼠空腹血糖的监测 | 第94页 |
| 6.3.7 敲除基因雌性小鼠糖耐量的监测 | 第94-95页 |
| 6.4 讨论 | 第95-97页 |
| 第七部分 结论与展望 | 第97-98页 |
| 7.1 结论 | 第97页 |
| 7.2 展望 | 第97-98页 |
| 致谢 | 第98-99页 |
| 参考文献 | 第99-110页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第110-112页 |
| 综述 | 第112-120页 |
| 参考文献 | 第118-120页 |
