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冠心病相关线粒体tRNAThr15927G>A突变致病机制的研究

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冠心病相关线粒体tRNAThr15927G>A突变致病机制的研究
论文目录
 
致谢第1-7页
摘要第7-9页
Abstract第9-18页
第一章 文献综述第18-35页
  1.1 冠心病的危险因素第18-22页
    1.1.1 不可变危险因素第18-19页
      1.1.1.1 遗传因素第18-19页
      1.1.1.2 年龄第19页
      1.1.1.3 性别第19页
    1.1.2 可变危险因素第19-22页
      1.1.2.1 生理因素第19-21页
      1.1.2.2 心理因素第21页
      1.1.2.3 行为因素第21-22页
      1.1.2.4 境因素第22页
  1.2 冠心病的遗传学基础第22-28页
    1.2.1 ABO血型基因第22-23页
    1.2.2 脂质代谢相关基因第23-26页
      1.2.2.1 脂蛋白相关基因第23-24页
      1.2.2.2 低密度脂蛋白受体及其调控基因第24页
      1.2.2.3 胆固醇,甘油三酯代谢和转运相关基因第24-26页
        1.2.2.3.1 羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因第25页
        1.2.2.3.2 ABC转运蛋白基因第25-26页
        1.2.2.3.3 卵磷脂:胆固醇酰基转移酶基因第26页
        1.2.2.3.4 脂肪酶基因第26页
    1.2.3 炎症反应相关基因第26-28页
      1.2.3.1 C-反应蛋白基因第26-27页
      1.2.3.2 5-脂氧合酶/白细胞三烯通路基因第27页
      1.2.3.3 肿瘤坏死因子基因第27-28页
    1.2.4 转录调控因子第28页
  1.3 冠心病与线粒体第28-35页
    1.3.1 线粒体基因组损伤与冠心病第29-30页
    1.3.2 线粒体氧化压力与冠心病第30-31页
    1.3.3 线粒体,炎症反应与冠心病第31-33页
    1.3.4 细胞凋亡与冠心病第33-35页
第二章 材料和方法第35-88页
  2.1 实验材料第35-39页
    2.1.1 血液样本第35页
    2.1.2 细胞样本第35页
    2.1.3 菌株第35页
    2.1.4 实验仪器第35-36页
    2.1.5 试剂盒第36页
    2.1.6 试剂第36-37页
    2.1.7 试剂的配制方法第37-39页
  2.2 实验方法第39-88页
    2.2.1 冠心病临床表型及相关危险因素分析第39页
    2.2.2 外周血样本的采集和永生化淋巴细胞系的建立第39-42页
      2.2.2.1 外周血样本的采集第39-40页
      2.2.2.2 永生化淋巴细胞系的建立第40-42页
    2.2.3 线粒体基因组突变分析第42-51页
      2.2.3.1 外周血DNA的提取第42-43页
      2.2.3.2 线粒体基因组测序第43-47页
      2.2.3.3 限制性酶切分析突变比例第47-51页
    2.2.4 线粒体tRNA及其氨酰化水平的检测第51-58页
      2.2.4.1 永生化淋巴细胞线粒体的提取第51-52页
      2.2.4.2 线粒体总RNA的提取第52-53页
      2.2.4.3 酸性环境下线粒体总RNA的提取第53-54页
      2.2.4.4 线粒体tRNA Northern Blot探针的标记第54-55页
      2.2.4.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳第55-57页
      2.2.4.6 转膜第57页
      2.2.4.7 杂交第57-58页
      2.2.4.8 洗膜第58页
      2.2.4.9 曝光及拍摄第58页
    2.2.5 线粒体蛋白质表达水平的检测第58-63页
      2.2.5.1 143B.TK~-细胞线粒体蛋白的放射性标记第59页
      2.2.5.2 淋巴细胞线粒体蛋白的放射性记第59-60页
      2.2.5.3 梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳分离线粒体蛋白质第60-63页
    2.2.6 线粒体氧耗的测定第63-65页
      2.2.6.1 完整细胞内源性总氧耗的测定第63-64页
      2.2.6.2 通透性细胞不同复合体氧耗的测定第64-65页
    2.2.7 线粒体活性氧产量的测定第65-66页
    2.2.8 线粒体呼吸链复合体酶活性的测定第66-73页
      2.2.8.1 永生化淋巴细胞线粒体的大量提取第66-67页
      2.2.8.2 线粒体蛋白浓度的测定第67页
      2.2.8.3 柠檬酸合酶活性的测定第67-68页
      2.2.8.4 线粒体呼吸链复合体Ⅰ酶活性的测定第68-69页
      2.2.8.5 线粒体呼吸链复合体Ⅱ酶活性的测定第69-71页
      2.2.8.6 线粒体呼吸链复合体Ⅲ酶活性的测定第71-72页
      2.2.8.7 线粒体呼吸链复合体Ⅳ酶活性的测定第72-73页
    2.2.9 线粒体形态的电子显微镜观察第73-74页
    2.2.10 线粒体分裂融合及自噬水平的测定第74-78页
      2.2.10.1 蛋白质样品的制备第74-75页
      2.2.10.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳第75-76页
      2.2.10.3 转膜第76-77页
      2.2.10.4 抗体杂交第77页
      2.2.10.5 显影和拍摄第77-78页
    2.2.11 线粒体苏氨酰-tRNA合成酶(TARS2)基因筛查第78-87页
      2.2.11.1 永久性类淋巴母细胞系总DNA的提取第78-79页
      2.2.11.2 TARS2基因外显子测序第79-81页
      2.2.11.3 Southern Blot检测TARS2基因有无大片段缺失或插入第81-87页
      2.2.11.4 Western Blot检测TARS2蛋白表达量第87页
    2.2.12 外显子组测序第87-88页
第三章 实验结果第88-116页
  3.1 母系遗传冠心病家系的发现第88-89页
  3.2 母系遗传冠心病家系的临床表型第89-92页
  3.3 外周血样本的采集和永生化淋巴细胞系的建立第92页
  3.4 母系遗传冠心病的发生与线粒体tRNAThr15927G>A突变相关第92-96页
  3.5 线粒体tRNA~(Thr)15927G>A突变为同质性突变第96-97页
  3.6 线粒体tRNA~(Thr)15927G>A突变在人群中的发生频率第97-99页
  3.7 15927G>A突变影响线粒体tRNA~(Thr)二级结构第99页
  3.8 15927G>A突变降低线粒体tRNA~(Thr)稳态水平第99-101页
  3.9 15927G>A突变降低线粒体tRNA~(Thr)氨酰化水平第101-102页
  3.10 15927G>A突变降低线粒体蛋白质表达水平第102-103页
  3.11 15927G>A突变降低线粒体氧耗第103-106页
  3.12 15927G>A突变导致线粒体ROS产量增加第106-107页
  3.13 15927G>A突变对线粒体氧化呼吸链复合体酶活性的影响第107-108页
  3.14 15927G>A突变对线粒体形态和结构影响第108-109页
  3.15 15927G>A突变对线粒体分裂融合及自噬的影响第109-112页
  3.16 线粒体苏氨酰-tRNA合成酶(TARS2)基因筛查未见异常第112-114页
  3.17 外显子组测序获得候选核修饰基因第114-116页
第四章 讨论第116-121页
  4.1 母系遗传冠心病家系的发现第116-117页
  4.2 冠心病与线粒体tRNA~(Thr)15927G>A突变相关第117页
  4.3 tRNA~(Thr)15927G>A突变可能通过导致线粒体功能障碍促进母系遗传冠心病的发生第117-119页
  4.4 线粒体tRNA~(Thr)15927G>A突变相关冠心病的发生可能有其他因素的参与第119-121页
第五章 结论第121-122页
第六章 研究中存在的问题与展望第122-123页
参考文献第123-139页
附录Ⅰ:英文缩略词表第139-141页
附录Ⅱ:论文相关科研成果第141页

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