论文目录 | |
| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-33页 |
| 1 细胞自噬概述 | 第13-15页 |
| 1.1 细胞自噬的定义及其生理功能 | 第13页 |
| 1.2 细胞自噬的分类 | 第13-15页 |
| 2 细胞自噬的调控 | 第15-16页 |
| 3 细胞自噬的分子机制 | 第16-21页 |
| 3.1 细胞自噬的发生及自噬体的形成 | 第17-18页 |
| 3.2 自噬体的延伸 | 第18-19页 |
| 3.3 自噬体的成熟及自噬-溶酶体的融合 | 第19页 |
| 3.4 细胞自噬对底物的选择性降解 | 第19-21页 |
| 4 细胞自噬领域中有待研究的重要问题 | 第21-22页 |
| 5 原纤毛 | 第22-28页 |
| 5.1 原纤毛的结构 | 第22-24页 |
| 5.2 原纤毛形成的分子机制 | 第24-25页 |
| 5.3 原纤毛形成的调控因子 | 第25-28页 |
| 6 原纤毛介导的信号通路 | 第28-31页 |
| 6.1 Hh信号通路 | 第28-29页 |
| 6.2 Wnt信号通路 | 第29页 |
| 6.3 PDGF信号通路 | 第29-30页 |
| 6.4 Hippo信号通路 | 第30-31页 |
| 7. 原纤毛与疾病的关系 | 第31-32页 |
| 7.1 原纤毛病变性疾病 | 第31页 |
| 7.2 原纤毛与癌症 | 第31-32页 |
| 8 原纤毛领域中有待研究的重要问题 | 第32-33页 |
| 第二章 细胞自噬途径新底物OFD1的发现 | 第33-72页 |
| 1 实验材料 | 第33-35页 |
| 1.1 细胞系 | 第33页 |
| 1.2 载体 | 第33-34页 |
| 1.3 抗体 | 第34页 |
| 1.4 试剂 | 第34-35页 |
| 2 实验方法 | 第35-46页 |
| 2.1 细胞培养和继代 | 第35-36页 |
| 2.2 细胞转染 | 第36页 |
| 2.3 细胞收集及裂解 | 第36页 |
| 2.4 Western Blotting | 第36-38页 |
| 2.5 可诱导型稳定表达靶蛋白的哺乳动物细胞系的建立 | 第38页 |
| 2.6 串联亲和纯化(Tandem Affinity Purification) | 第38-40页 |
| 2.7 银染 | 第40-41页 |
| 2.8 免疫共沉淀 | 第41页 |
| 2.9 细胞自噬的调控及活性检测 | 第41-43页 |
| 2.10 定量—PCR | 第43-45页 |
| 2.11 免疫荧光检测和激光共聚焦显微镜的使用 | 第45-46页 |
| 3 实验结果 | 第46-72页 |
| 3.1 细胞自噬分子标记LC3与多个中心体微卫星蛋白互作 | 第46-51页 |
| 3.1.1 串联亲和纯化技术(TAP)简介 | 第47-48页 |
| 3.1.2 LC3及其同源物的串联亲和纯化结果 | 第48-49页 |
| 3.1.3 PCM1,OFD1和LC3存在于同一个蛋白复合体内 | 第49-51页 |
| 3.2 血清饥饿激活细胞自噬途径并降解OFD1 | 第51-57页 |
| 3.2.1 OFD1是细胞自噬的新底物 | 第52-54页 |
| 3.2.2 OFD1的mRNA含量检测 | 第54-55页 |
| 3.2.3 抑制细胞自噬的发生阻断OFD1的降解 | 第55-56页 |
| 3.2.4 细胞自噬途径特异性降解定位于中心体微卫星处的OFD1 | 第56-57页 |
| 3.3 细胞自噬途径特异性降解定位于中心体微卫星处的OFD1 | 第57-72页 |
| 3.3.1 血清饥饿诱导自噬体分子标记LC3和中心体微卫星分子标记PCM1共定位 | 第57-62页 |
| 3.3.2 血清饥饿诱导RPE1细胞中心体微卫星处OFD1的降解 | 第62-64页 |
| 3.3.3 血清饥饿诱导的中心体微卫星处OFD1降解是通过细胞自噬途径实现的 | 第64-66页 |
| 3.3.4 血清饥饿专一性诱导中心体微卫星处OFD1的降解,并不影响中心体微卫星的结构及其稳定性 | 第66-69页 |
| 3.3.5 位于中心粒远端的OFD1比中心体微卫星处的OFD1更加稳定 | 第69-72页 |
| 第三章 细胞自噬促进原纤毛的形成 | 第72-91页 |
| 1 实验材料 | 第72页 |
| 1.1 细胞系 | 第72页 |
| 1.2 载体 | 第72页 |
| 1.3 抗体 | 第72页 |
| 1.4 试剂 | 第72页 |
| 2 实验方法 | 第72-75页 |
| 2.1 细胞周期检测 | 第72-73页 |
| 2.2 诱导细胞形成原纤毛 | 第73页 |
| 2.3 构建稳定shRNA干扰细胞系 | 第73-75页 |
| 3 实验结果 | 第75-91页 |
| 3.1 细胞自噬通过降解中心体微卫星处的OFD1促进原纤毛的形成 | 第75-82页 |
| 3.1.1 细胞自噬Atg5野生型细胞更容易形成原纤毛 | 第76-77页 |
| 3.1.2 原纤毛形成的表型差异不是由细胞周期不同引起的 | 第77-78页 |
| 3.1.3 Atg3~(+/+)与Atg5~(+/+)小鼠胚胎纤维元细胞的表型类似 | 第78-79页 |
| 3.1.4 CQ有效抑制Atg~(+/+)小鼠胚胎纤维元细胞原纤毛的形成 | 第79-81页 |
| 3.1.5 Atg5~(-/-)产小鼠胚胎纤维元细胞内,BBS4向原纤毛内的运输受阻 | 第81-82页 |
| 3.2 shRNA介导的基因沉默有效降低OFD1在中心体微卫星处的表达,并促进原纤毛的形成 | 第82-91页 |
| 3.2.1 稳定shRNA干扰细胞系的构建及验证 | 第82-85页 |
| 3.2.2 Atg5~(-/-)小鼠胚胎纤维元细胞稳定shRNA干扰细胞系能够回复到野生型的表型 | 第85-87页 |
| 3.2.3 shRNA介到的OFD1基因沉默诱导Atg5~(+/+)小鼠胚胎纤维元细胞更为有效地形成原纤毛 | 第87-91页 |
| 第四章 特异性降低OFD1在中心体微卫星处的表达量促使乳腺癌细胞系MCF7重建原纤毛 | 第91-101页 |
| 1 实验材料 | 第91页 |
| 1.1 细胞系 | 第91页 |
| 1.2 抗体 | 第91页 |
| 2 实验方法 | 第91-92页 |
| 2.1 构建稳定shRNA干扰细胞系 | 第91页 |
| 2.2 扫描电镜样品制备及观察 | 第91-92页 |
| 3 实验结果 | 第92-101页 |
| 3.1 MCF7细胞shRNA介导的OFD1基因沉默细胞系的构建及鉴定 | 第92-95页 |
| 3.2 MCF7细胞shRNA介导的OFD1基因沉默细胞系能够重建原纤毛 | 第95-101页 |
| 第五章 总结和展望 | 第101-110页 |
| 1. 研究结果 | 第101-103页 |
| 2. 展望 | 第103-110页 |
| 2.1 探索重建原纤毛对癌细胞的影响 | 第103-105页 |
| 2.2 探索细胞自噬对纤毛病变性疾病的调节 | 第105页 |
| 2.3 探索定位于中心体微卫星处OFD1抑制原纤毛形成的分子机制 | 第105-107页 |
| 2.4 探索细胞自噬对于OFD1及原纤毛形成调控的分子机制 | 第107-108页 |
| 2.5 探索原纤毛对细胞自噬途径的调节作用 | 第108-110页 |
| 参考文献 | 第110-116页 |
| 缩略词表 | 第116-118页 |
| 攻读学位期间的科研成果 | 第118-119页 |
| 致谢 | 第119-120页 |
