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传染性法氏囊病病毒全基因组克隆及反向遗传系统的建立

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传染性法氏囊病病毒全基因组克隆及反向遗传系统的建立
论文目录
 
第1章 一般性引言第16-21页
1.1 研究背景、基础和意义第16-17页
1.2 拟解决问题及研究内容第17-19页
1.3 技术路线第19-21页
第2章 文献综述第21-61页
2.1 动物RNA病毒的拯救及反向遗传系统第21-46页
2.1.1 早期发展历史第22-23页
2.1.2 一般病毒拯救体系的方法学第23-29页
2.1.2.1 概述第23-24页
2.1.2.2 VV/T7系统及基于T7 RNA聚合酶的替代系统第24-26页
2.1.2.3 体外转录第26-28页
2.1.2.4 RNA polⅡ系统第28页
2.1.2.5 RNA polⅠ系统第28-29页
2.1.3 正链RNA病毒的拯救第29-38页
2.1.3.1 脊髓灰质炎病毒:无细胞体系的从头合成第29-30页
2.1.3.2 冠状病毒:定向重组、克隆载体与系统性体外装配第30-32页
2.1.3.3 黄病毒:不稳定克隆和准种特性第32-35页
2.1.3.4 野田村病毒:病毒-宿主相互作用第35-36页
2.1.3.5 甲病毒:从病毒拯救到病毒载体第36-38页
2.1.4 负链RNA病毒的拯救第38-43页
2.1.4.1 流感病毒(正粘病毒):负链RNA病毒遗传拯救的发展见证第38-40页
2.1.4.2 其它分节段RNA病毒:微基因组、双义编码第40-42页
2.1.4.3 不分节段负链(NNS)RNA病毒:转录反基因组和比较反式作用蛋白第42-43页
2.1.5 双链RNA病毒的拯救第43-45页
2.1.5.1 双RNA病毒科第43页
2.1.5.2 呼肠孤病毒科:基因组节段重配——最后的挑战第43-45页
2.1.6 展望第45-46页
2.2 长距离RT-PCR方法及其在RNA病毒基因组扩增上的应用第46-52页
2.2.1 反转录反应第47-49页
2.2.1.1 反转录酶的选择:SuperscriptⅡ第47页
2.2.1.2 RNA模板完整性和纯度:RT反应的关键参数第47-48页
2.2.1.3 RT反应的调整和优化第48-49页
2.2.2 PCR反应第49-51页
2.2.2.1 引物设计第49页
2.2.2.2 聚合酶第49-50页
2.2.2.3 PCR循环参数及其它条件优化第50-51页
2.2.2.4 PCR产物的克隆第51页
2.2.3 长距离RT-PCR Vs.分段克隆再拼接第51-52页
2.3 新技术防治传染性法氏囊病的研究进展和思考第52-61页
2.3.1 与疫苗有关的IBDV分子生物学进展第52-56页
2.3.1.1 IBDV病毒粒子的立体结构第53页
2.3.1.2 VP1第53页
2.3.1.3 VP5第53-54页
2.3.1.4 VP3第54页
2.3.1.5 VP2第54-56页
2.3.1.6 嵌合IBDV第56页
2.3.2 新型疫苗研制第56-59页
2.3.2.1 重组亚单位疫苗第56-57页
2.3.2.2 病毒样颗粒(VLPs)第57页
2.3.2.3 重组活载体疫苗第57-58页
2.3.2.4 高压力失活病毒第58-59页
2.3.2.5 核酸疫苗第59页
2.3.3 展望第59-61页
第3章 实验材料和常规方法第61-71页
3.1 病毒、菌株、细胞和基因工程载体第61页
3.2 引物一览表(详见以下各章研究内容)第61页
3.3 主要分子生物学试剂和试剂盒第61-63页
3.4 常用试剂及配制第63-65页
3.5 病毒分离、纯化和基因组抽提第65-67页
3.5.1 超速离心纯化病毒第65-66页
3.5.2 透析袋浓缩纯化病毒第66页
3.5.3 蛋白酶K/酚/氯仿法抽提病毒dsRNA基因组第66-67页
3.5.4 TRIzol抽提病毒dsRNA基因组第67页
3.5.5 LiCl进一步纯化dsRNA第67页
3.6 反转录和各类PCR方法第67-71页
3.6.1 反转录(RT)第67-68页
3.6.2 酚/氯仿抽提RT反应液第68-69页
3.6.3 常规PCR第69页
3.6.4 长距离PCR(Long PCR)第69-71页
3.6.4.1 (方案Ⅰ)采用Roche公司Expand High Fidelity PCR System第69-70页
3.6.4.2 (方案Ⅱ)采用TaKaRa公司One Shot LA PCR Mix第70-71页
3.6.5 重组PCR(融合PCR)第71页
3.7 基因克隆第71-82页
3.7.1 PCR产物纯化第71-73页
3.7.1.1 低熔点胶回收法第71-72页
3.7.1.2 UNIQ-5试剂盒DNA凝胶回收法第72-73页
3.7.2 双酶切定向克隆法第73-74页
3.7.2.1 感受态细胞制备第73页
3.7.2.2 DNA双酶切及酶切产物纯化第73-74页
3.7.2.3 连接(用DNA Ligation Kit Ver.2进行)第74页
3.7.2.4 转化及细菌培养第74页
3.7.3 T载体克隆法第74-75页
3.7.4 单酶切非定向克隆法第75-76页
3.7.5 重组克隆鉴定第76-77页
3.7.5.1 碱裂解法小量制备质粒DNA第76页
3.7.5.2 异丙醇法快速提取质粒DNA第76-77页
3.7.5.3 酶切及PCR鉴定第77页
3.7.5.4 甘油菌菌种保存第77页
3.7.5.5 序列测定第77页
3.8 Vero细胞培养与传代第77页
3.9 病毒拯救及检测方法第77-82页
3.9.1 重组质粒超纯纯化(Concert~(TM) High purity Plasmid Purification System Kit)第77-78页
3.9.2 转染第78-79页
3.9.3 Northern RNA点杂交第79-80页
3.9.3.1 细胞总RNA的提取第79页
3.9.3.2 RNA点膜第79页
3.9.3.3 探针标记第79-80页
3.9.3.4 预杂交、杂交和洗膜第80页
3.9.3.5 免疫检测第80页
3.9.4 免疫荧光第80-81页
3.9.5 电镜观察第81-82页
第4章 长距离RT-PCR扩增并克隆IBDV浙江分离株双节段基因组第82-96页
4.1 引言第82页
4.2 设计思路第82-83页
4.3 实验内容和结果第83-94页
4.3.1 蛋白酶K/酚/氯仿法可有效抽提IBDV dsRNA基因组第83-85页
4.3.2 IBDV HZ2株A节段全长基因组的一步扩增第85-87页
4.3.3 用T载体克隆IBDV HZ2株A节段cDNA第87-90页
4.3.4 IBDV HZ2株和JD1株B节段的一步扩增和克隆第90-94页
4.4 讨论第94-96页
第5章 IBDV浙江分离株全基因组生物信息学分析第96-110页
5.1 引言第96页
5.2 所用的序列分析及生物信息学软件第96页
5.3 分析与讨论第96-110页
5.3.1 A节段非编码区(NCR)结构第96-98页
5.3.2 A节段ORFA2及其编码的VP5蛋白第98-100页
5.3.3 A节段ORFA1及其编码的VP2、VP4、VP3蛋白第100-103页
5.3.4 HZ2株和JD1株B节段VP1基因在上游5′-非编码区有一个同框起始密码第103-107页
5.3.5 VP1蛋白上潜在的毒力氨基酸位点分析第107-110页
第6章 IBDV基因组cDNA序列的定点突变第110-133页
6.1 引言第110页
6.2 设计思路和实验方案第110-111页
6.3 实验内容和结果第111-131页
6.3.1 “Head-to-tail”A节段双价重组表达载体第111-116页
6.3.2 定点突变(Ⅰ):A节段上引入NaeI及在3′-NCR插入G;在B节段上引入EcoRV第116-123页
6.3.3 含有突变标记的A节段和B节段真核表达载体构建第123-127页
6.3.4 定点突变(Ⅱ):A节段上引入NaeI位点,及在3′-NCR插入C第127-131页
6.4 讨论第131-133页
第7章 IBDV反向遗传系统的建立第133-142页
7.1 引言第133页
7.2 设计思路第133页
7.3 实验内容和结果第133-140页
7.3.1 共转染“被标记”的IBDV双节段cDNA重组子可在Vero细胞表达第133-135页
7.3.2 共转染“被标记”的IBDV双节段cDNA重组子可以拯救IBDV第135-138页
7.3.3 A节段3′-NCR插入突变的IBDV表型第138-140页
7.4 讨论第140-142页
第8章 总结与展望第142-146页
8.1 结论与主要创新点:第142-144页
8.2 研究工作意义第144-145页
8.3 展望第145-146页
参考文献第146-155页
附录第155-156页

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