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鸭源鸡杆ompW基因对菌体抗逆和致病性的影响机制及flfA基因突变菌株的构建

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鸭源鸡杆ompW基因对菌体抗逆和致病性的影响机制及flfA基因突变菌株的构建
论文目录
 
致谢第1-11页
摘要第11-14页
文献综述第14-29页
1 鸭源鸡杆菌第14-21页
  1.1 病原学第14-15页
    1.1.1 分类地位第14页
    1.1.2 理化特性第14-15页
  1.2 禽类鸭源鸡杆菌感染现状第15-16页
  1.3 鸭源鸡杆菌种群演化动态第16-17页
  1.4 鸭源鸡杆菌的传播途径第17页
  1.5 鸭源鸡杆菌的致病性第17-19页
  1.6 临床症状及病理变化第19-20页
  1.7 分子生物学检测诊断方法第20-21页
    1.7.1 聚合酶链式反应第20页
    1.7.2 荧光原位杂交第20-21页
    1.7.3 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱第21页
2 鸭源鸡杆菌毒力因子及其致病机理研究进展第21-27页
  2.1 菌毛第21-22页
  2.2 荚膜第22页
  2.3 生物被膜第22-23页
  2.4 外膜囊泡第23页
  2.5 RTX样毒素GtxA第23-25页
  2.6 金属蛋白酶第25页
  2.7 血凝素第25页
  2.8 耐药因子第25-27页
3 细菌外膜蛋白W的研究进展第27-29页
  3.1 概述第27页
  3.2 增强细菌环境适应能力第27页
  3.3 参与耐药性的形成第27-28页
  3.4 具有免疫原性第28页
  3.5 与细菌致病性相关第28-29页
  3.6 抵抗宿主天然免疫防御第29页
本研究目的和意义第29-30页
第一部分 鸭源鸡杆菌ompW基因缺失株的构建及第30-47页
1 引言第30页
2 材料与方法第30-40页
  2.1 菌株与质粒第30页
  2.2 培养基及主要试剂第30页
  2.3 主要仪器第30-31页
  2.4 主要培养基及溶液的配制第31-32页
    2.4.1 M-IV液体培养基第31页
    2.4.2 SDS-PAGE缓冲液第31-32页
    2.4.3 Western Blotting缓冲液第32页
  2.5 方法第32-40页
    2.5.1 菌种复苏及细菌基因组DNA提取第32页
    2.5.2 质粒提取第32页
    2.5.3 鸭源鸡杆菌ompW突变菌株的构建第32-37页
    2.5.4 鸭源鸡杆菌突变株ΔompW鉴定第37-38页
    2.5.5 菌株的生长特性研究第38-39页
    2.5.6 菌株溶血活性及生长形态观察第39页
    2.5.7 自身凝集测定第39页
    2.5.8 MIC测定第39-40页
3 结果与分析第40-45页
  3.1 扩增出ompW基因上下游同源臂及Cmp抗性基因第40页
  3.2 成功构建出质粒pUC18-ompW-U-C-D第40-41页
  3.3 鸭源鸡杆菌突变株ΔompW的鉴定第41-43页
    3.3.1 PCR扩增出Cmp抗性基因及ompW基因的两端片段第41-42页
    3.3.2 细菌外膜蛋白的SDS-PAGE分析第42页
    3.3.3 Western Blotting检测证明ΔompW不表达OmpW第42-43页
  3.4 ΔompW与其亲本株生长性能相似第43页
  3.5 RZ和ΔompW菌株溶血活性及生长形态未变第43-44页
  3.6 ΔompW自身凝集能力下降第44页
  3.7 ΔompW对四环素类药物敏感性显著升高第44-45页
4 讨论与结论第45-47页
  4.1 应用自然转化法成功构建出鸭源鸡杆菌突变株△ompW第45页
  4.2 OmpW在鸭源鸡杆菌抵抗四环素中发挥重要作用第45-47页
第二部分 RZ与ΔompW的抗应激研究第47-57页
1 引言第47页
2 材料与方法第47-51页
  2.1 菌株第47页
  2.2 培养基及主要试剂第47页
  2.3 主要仪器第47-48页
  2.4 方法第48-51页
    2.4.1 菌种复苏与培养第48页
    2.4.2 不同盐度下的生长特性第48页
    2.4.3 不同盐度下OMPs的SDS-PAGE分析第48页
    2.4.4 不同盐度下OmpW的Western Blotting分析第48页
    2.4.5 Real-time PCR分析不同盐度下细菌OmpW mRNA转录水平第48-50页
    2.4.6 细菌的应激抵抗力测定第50-51页
3 结果与分析第51-55页
  3.1 ΔompW的生长受高渗透环境影响更大第51页
  3.2 高渗透压下G.anatis OmpW表达上调第51-52页
  3.3 鸭源鸡杆菌OmpW mRNA相对转录水平分析第52-55页
  3.4 ompW缺失降低了应激抵抗力第55页
4 讨论与结论第55-57页
  4.1 OmpW是鸭源鸡杆菌调节NaCl所必需的第55-56页
  4.2 OmpW与鸭源鸡杆菌耐氧化及热应激有一定相关性第56-57页
第三部分 RZ与ΔompW的血清杀菌机制的初步探究第57-63页
1 引言第57页
2 材料与方法第57-59页
  2.1 菌株第57页
  2.2 主要试剂和培养基第57页
  2.3 主要仪器第57页
  2.4 方法第57-59页
    2.4.1 菌种复苏第57页
    2.4.2 血清的制备第57-58页
    2.4.3 不同浓度血清中的生存率比较第58页
    2.4.4 不同浓度血清条件下OmpW的Western Blotting分析第58页
    2.4.6 不同浓度血清中鸭源鸡杆菌OmpW mRNA转录水平的变化第58页
    2.4.7 血清杀菌通路的初步探究第58-59页
3 结果与分析第59-61页
  3.1 OmpW缺失使血清杀菌能力下降第59页
  3.2 抵抗血清杀菌时OmpW表达上调第59-60页
  3.3 抵抗血清杀菌时OmpW mRNA转录上调第60-61页
  3.4 鸭源鸡杆菌通过旁路通路激活补体系统第61页
4 讨论与结论第61-63页
  4.1 OmpW在鸭源鸡杆菌血清杀菌中发挥重要作用第61-62页
  4.2 OmpW抑制补体旁路通路发挥耐血清杀菌活性第62-63页
第四部分 RZ与ΔompW致病力的研究第63-71页
1 引言第63页
2 材料与方法第63-65页
  2.1 菌株和试验动物第63页
  2.2 主要试剂第63页
  2.3 细菌培养第63页
  2.4 小鼠半数致死量(LD_(50))的测定第63-64页
  2.5 对小鼠致病力分析第64页
  2.6 鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞黏附性定第64页
    2.6.1 鸡输卵管原代细胞的制备与培养第64页
    2.6.2 鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞体黏附测定第64页
  2.7 生物被膜形成测定第64-65页
    2.7.1 生物被膜的培养第64-65页
    2.7.2 结晶紫染色法定量测定生物被膜形成量第65页
3 结果与分析第65-69页
  3.1 OmpW缺失使G.anatis对小鼠的LD_(50)提高第65页
  3.2 RZ与ΔompW对小鼠的致病性无显著差异第65-67页
  3.3 RZ和ΔompW对鸡原代输卵管上皮细胞黏附能力相似第67页
  3.4 RZ和ΔompW生物被膜形成能力相似第67-69页
4 讨论与结论第69-71页
  4.1 OmpW缺失后不影响鸭源鸡杆菌对小鼠的致病力第69页
  4.2 OmpW参与鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附第69页
  4.3 OmpW对鸭源鸡杆菌生物被膜形成影响很小第69-71页
第五部分 鸭源鸡杆菌flfA缺失菌株的构建及其生物学特性研究第71-80页
1 引言第71页
2 材料与方法第71-75页
  2.1 菌株与质粒第71页
  2.2 培养基及主要试剂第71页
  2.3 主要仪器第71页
  2.4 主要溶液的配制第71页
  2.5 方法第71-75页
    2.5.1 菌种复苏及鸭源鸡杆菌基因组的提取第71页
    2.5.2 质粒提取第71-72页
    2.5.3 鸭源鸡杆菌flfA突变菌株的构建第72-73页
    2.5.3 Cmp抗性盒子的扩增及鉴定第73页
    2.5.4 PCR扩增flfA基因上下游同源臂第73页
    2.5.5 PCR产物的酶切及其产物的纯化第73页
    2.5.6 重组质粒pUC18-U-C-D的构建第73-74页
    2.5.7 重组质粒的酶切鉴定第74页
    2.5.8 重组质粒的PCR鉴定第74页
    2.5.9 线性DNA打靶片段的扩增第74页
    2.5.10 鸭源鸡杆菌感受态细胞的制备第74页
    2.5.11 线性DNA打靶片段转化第74页
    2.5.12 鸭源鸡杆菌突变株ΔflfA鉴定第74-75页
    2.5.13 鸭源鸡杆菌突变株ΔflfA生物学特性研究第75页
3 结果与分析第75-79页
  3.1 扩增出flfA基因上下游同源臂及Cmp抗性基因第75-76页
  3.2 成功构建出质粒pUC18-flfA-U-C-D第76页
  3.3 鸭源鸡杆菌突变株AflfA的鉴定第76-77页
    3.3.1 PCR扩增出Cmp抗性基因及flfA基因的两端片段第76-77页
    3.3.2 Western Blotting鉴定出ΔflfA不表达FlfA第77页
  3.4 RZ和ΔflfA生长性能及菌落形态相似第77-78页
  3.5 ΔflfA对鸡原代输卵管上皮细胞黏附能力下降第78-79页
4 讨论与结论第79-80页
  4.1 成功构建了鸭源鸡杆菌flfA缺失突变菌株第79页
  4.2 菌毛在鸭源鸡杆菌黏附鸡原代输卵管上皮细胞中发挥主导作用第79-80页
全文结论第80-81页
本研究创新点第81-82页
参考文献第82-97页
Abstract第97-101页
附录1:英文缩写词表第101-102页
附录2:作者简介第102-103页

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