论文目录 | |
| 摘要 | 第1-7页 |
| abstract | 第7-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-26页 |
| 1.1 鱼类细胞培养 | 第14-17页 |
| 1.1.1 鱼类细胞研究历史 | 第14-15页 |
| 1.1.2 鱼类细胞系培养方法 | 第15-16页 |
| 1.1.3 肿大细胞病毒敏感细胞系的现状 | 第16-17页 |
| 1.1.4 鱼类细胞系保藏现状 | 第17页 |
| 1.2 传染性脾肾坏死病毒 | 第17-24页 |
| 1.2.1 ISKNV的发现及确定 | 第17-18页 |
| 1.2.2 ISKNV的结构及形态发生 | 第18页 |
| 1.2.3 ISKNV的临床症状及组织病理特性 | 第18页 |
| 1.2.4 ISKNV的流行病学 | 第18-23页 |
| 1.2.5 ISKNV疫苗研究 | 第23-24页 |
| 1.3 谷氨酰胺（GLUTAMINE，GLN）代谢与病毒感染 | 第24-25页 |
| 1.4 选题的目的意义 | 第25-26页 |
| 第二章 鳜脑组织细胞系的建立及其对ISKNV敏感性研究 | 第26-45页 |
| 2.1 试验材料与方法 | 第26-35页 |
| 2.1.1 实验鱼、病毒、质粒、抗体 | 第26-27页 |
| 2.1.2 原代培养 | 第27页 |
| 2.1.3 传代培养 | 第27页 |
| 2.1.4 细胞冻存 | 第27-28页 |
| 2.1.5 细胞复苏 | 第28页 |
| 2.1.6 核型分析 | 第28-29页 |
| 2.1.7 细胞生长特性测定 | 第29页 |
| 2.1.8 细胞转染效率的测定 | 第29-30页 |
| 2.1.9 ISKNV对CPB细胞感染及滴度测定 | 第30-31页 |
| 2.1.10 ORF006（MCP）在病毒感染细胞中的转录分析 | 第31-33页 |
| 2.1.11 MCP在病毒感染细胞内的鉴定 | 第33-34页 |
| 2.1.12 透射电镜观察 | 第34页 |
| 2.1.13 回归感染试验 | 第34页 |
| 2.1.14 CPB对鱼类弹状病毒的分离 | 第34-35页 |
| 2.2 实验结果与分析 | 第35-43页 |
| 2.2.1 CPB细胞系的建立及其特性 | 第35-36页 |
| 2.2.2 核型分析 | 第36-37页 |
| 2.2.3 细胞最适培养条件 | 第37页 |
| 2.2.4 外源基因在CPB细胞中的表达 | 第37-38页 |
| 2.2.5 ISKNV感染CPB产生的CPE及滴度测定 | 第38-39页 |
| 2.2.6 病毒ORF006（MCP）基因在CPB细胞内的转录、表达 | 第39-40页 |
| 2.2.7 病毒感染细胞后的透射电镜观察 | 第40页 |
| 2.2.8 ISKNV细胞感染液对鳜鱼的致病性 | 第40-41页 |
| 2.2.9 CPB对弹状病毒的分离 | 第41-43页 |
| 2.3 讨论 | 第43-44页 |
| 2.4 小结 | 第44-45页 |
| 第三章 荧光定量PCR检测鳜传染性脾肾坏死病毒含量的方法 | 第45-55页 |
| 3.1 实验材料与方法 | 第45-49页 |
| 3.1.1 细胞、病毒、质粒 | 第45页 |
| 3.1.2 病毒感染细胞总DNA的提取 | 第45-46页 |
| 3.1.3 ISKNV ORF007引物设计及PCR扩增 | 第46-47页 |
| 3.1.4 PCR产物胶回收 | 第47页 |
| 3.1.5 回收产物的酶切及纯化 | 第47页 |
| 3.1.6 pcDNA3.1+质粒的提取、酶切和纯化 | 第47页 |
| 3.1.7 载体与基因的连接 | 第47页 |
| 3.1.8 重组质粒的转化 | 第47-48页 |
| 3.1.9 转化子的筛选与鉴定 | 第48页 |
| 3.1.10 荧光定量PCR引物和探针的设计与合成 | 第48页 |
| 3.1.11 标准曲线的建立及灵敏度检测 | 第48页 |
| 3.1.12 特异性和重复性试验 | 第48-49页 |
| 3.1.13 荧光定量PCR检测病毒滴度 | 第49页 |
| 3.1.14 细胞病变法（CPE）测定病毒滴度 | 第49页 |
| 3.2 结果 | 第49-53页 |
| 3.2.1 pcDNA007质粒的构建 | 第49-50页 |
| 3.2.2 定量PCR检测方法的建立 | 第50-52页 |
| 3.2.3 定量PCR法检测不同滴度病毒含量 | 第52页 |
| 3.2.4 CPE法测得病毒滴度 | 第52页 |
| 3.2.5 两种方法测得病毒滴度的比较 | 第52-53页 |
| 3.3 讨论 | 第53-54页 |
| 3.4 小结 | 第54-55页 |
| 第四章 鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 | 第55-64页 |
| 4.1 材料与方法 | 第55-59页 |
| 4.1.1 细胞、毒株、菌株、实验动物 | 第55-56页 |
| 4.1.2 重组MCP蛋白的表达 | 第56页 |
| 4.1.3 重组MCP蛋白的纯化 | 第56页 |
| 4.1.4 重组MCP蛋白的复性 | 第56页 |
| 4.1.5 病毒培养 | 第56-57页 |
| 4.1.6 动物免疫 | 第57页 |
| 4.1.7 细胞融合与杂交瘤细胞株的克隆筛选 | 第57页 |
| 4.1.8 ELISA筛选阳性孔 | 第57页 |
| 4.1.9 间接免疫荧光法筛选阳性孔 | 第57-58页 |
| 4.1.10 阳性细胞亚克隆及扩大培养 | 第58页 |
| 4.1.11 抗体特异性鉴定 | 第58页 |
| 4.1.12 单抗亚类鉴定 | 第58页 |
| 4.1.13 单抗腹水制备及效价测定 | 第58页 |
| 4.1.14 单抗腹水的应用 | 第58-59页 |
| 4.2 结果 | 第59-62页 |
| 4.2.1 抗原的纯化 | 第59页 |
| 4.2.2 杂交瘤细胞系构建及抗体效价测定 | 第59-60页 |
| 4.2.3 单克隆抗体亚类 | 第60页 |
| 4.2.4 单克隆抗体的特异性 | 第60-61页 |
| 4.2.5 间接免疫荧光实验 | 第61页 |
| 4.2.6 免疫印迹分析 | 第61-62页 |
| 4.3 讨论 | 第62-63页 |
| 4.4 小结 | 第63-64页 |
| 第五章 鳜传染性脾肾坏死病毒增殖复制依赖于谷氨酰胺（GLN）的机制研究 | 第64-77页 |
| 5.1 材料与方法 | 第64-66页 |
| 5.1.1 细胞和病毒 | 第64页 |
| 5.1.2 谷氨酰胺饥饿实验 | 第64-65页 |
| 5.1.3 TCA抑制及介质回补实验 | 第65页 |
| 5.1.4 细胞活力测定 | 第65页 |
| 5.1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 | 第65页 |
| 5.1.6 ATP含量测定及ATP拯救实验 | 第65-66页 |
| 5.1.7 ATP拯救实验 | 第66页 |
| 5.1.8 GSH合成抑制和GSHe回补实验 | 第66页 |
| 5.1.9 细胞上清病毒DNA的提取 | 第66页 |
| 5.1.10 间接免疫荧光 | 第66页 |
| 5.1.11 免疫印记分析 | 第66页 |
| 5.2 实验结果与分析 | 第66-75页 |
| 5.2.1 缺失Gln不影响CPB细胞生长 | 第66-67页 |
| 5.2.2 缺失Gln影响病毒产量 | 第67页 |
| 5.2.3 Gln通过回补TCA中间代谢产物促进ISKNV增殖 | 第67-71页 |
| 5.2.4 Gln为病毒增殖提供能量ATP促进病毒释放 | 第71-73页 |
| 5.2.5 Gln为病毒增殖提供适量的谷胱甘肽 | 第73-75页 |
| 5.3 讨论 | 第75-76页 |
| 5.4 小结 | 第76-77页 |
| 结论 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-86页 |
| 附录 | 第86-89页 |
| 缩略词 | 第89-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
| 个人简介 | 第93-94页 |
