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K88ac+产肠毒素大肠杆菌相关新毒力因子的研究

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K88ac+产肠毒素大肠杆菌相关新毒力因子的研究
论文目录
 
中文摘要第1-6页
Abstract第6-16页
符号说明第16-18页
文献综述第18-47页
综述一 K88+产肠毒素大肠杆菌毒力因子研究进展第18-26页
  1. 黏附素第18-19页
  1.1 K88菌毛第18页
  1.2 Ⅰ型菌毛第18-19页
  1.3 共生菌毛第19页
  1.4 非菌毛黏附素第19页
  2. 肠毒素第19-20页
  2.1 热敏肠毒素第19页
  2.2 热稳定肠毒素第19-20页
  2.3 肠聚集性耐热毒素第20页
  3. 其他毒力因子第20-21页
  3.1 溶血素第20页
  3.2 SepA第20-21页
展望第21页
参考文献第21-26页
综述二 大肠杆菌鞭毛研究进展第26-47页
  1. 鞭毛的结构和装配第26-27页
  2. 鞭毛表达的基因调节第27-29页
  3. 大肠杆菌鞭毛H抗原分型第29-31页
  4. 鞭毛的功能第31-35页
  4.1 运动性和趋化性第31-32页
  4.2 鞭毛Ⅲ型分泌系统第32-33页
  4.3 鞭毛影响细菌黏附第33-34页
  4.4 鞭毛介导的生物被膜形成第34-35页
  4.5 鞭毛蛋白刺激机体产生促炎性反应第35页
  5. 研究展望第35-36页
参考文献第36-47页
试验研究第47-127页
研究一 K88ac+产肠毒素大肠杆菌鞭毛和K88菌毛的协同调控第47-74页
  1. 材料第48-49页
  1.1 菌株与质粒第48-49页
  1.2 主要试剂第49页
  1.3 主要仪器第49页
  2. 方法第49-60页
  2.1 缺失株的构建第49-53页
    2.1.1 引物设计第49-50页
    2.1.2 融合PCR产物的制备与纯化第50-51页
    2.1.3 感受态细胞的制备及转化第51-52页
      2.1.3.1 感受态细胞的制备第51页
      2.1.3.2 质粒pKD46的转化第51页
      2.1.3.3 Red重组酶的诱导和感受态细胞的制备第51-52页
      2.1.3.4 电转化第52页
    2.1.4 一次重组株的PCR鉴定第52-53页
    2.1.5 质粒pKD46的消除第53页
    2.1.6 二次重组和质粒pCP20的消除第53页
    2.1.7 C83902ΔfaeG,C83902ΔmotA,C83902ΔfliCΔfaeG缺失株的构建第53页
  2.2 回补株的构建第53-55页
    2.2.1 回补质粒的构建第53-55页
    2.2.2 回补株的构建第55页
  2.3 FliC多克隆抗体的制备第55-56页
    2.3.1 重组FliC蛋白原核表达引物的设计和载体构建第55页
    2.3.2 重组FliC蛋白的原核表达和纯化第55页
    2.3.3 重组FliC蛋白免疫小鼠第55-56页
    2.3.4 ELISA检测血清效价第56页
    2.3.5 鼠源FliC多抗血清的制备第56页
  2.4 半固体运动试验第56页
  2.5 透射电镜观察第56页
  2.6 玻板凝集试验检测缺失株中FliC和FaeG的表达第56-57页
  2.7 生长试验第57页
  2.8 细胞黏附试验第57-58页
    2.8.1 细胞培养和技术第57页
    2.8.2 细胞黏附试验和黏附抑制试验第57-58页
  2.9 qRT-PCR检测fliC和faeG的表达第58-60页
    2.9.1 待测基因的引物设计第58页
    2.9.2 提取细菌总RNA第58页
    2.9.3 去除基因组DNA和反转录cDNA第一链第58-59页
    2.9.4 qRT-PCR第59-60页
    2.9.5 数据的分析和处理第60页
  3. 结果第60-70页
  3.1 基因缺失株的构建第60-63页
    3.1.1 融合PCR产物的制备第60-61页
    3.1.2 C83902ΔfliC::Cat 一次重组菌的鉴定第61页
    3.1.3 C83902ΔfliC二次重组菌的鉴定第61-62页
    3.1.4 C83902ΔfaeG,C83902ΔmotA和C83902ΔfliCΔfaeG二次重组菌的鉴定第62-63页
  3.2 回补质粒的鉴定第63-64页
  3.3 鼠抗FliC多克隆抗体的制备第64-65页
    3.3.1 重组质粒pCold-TF-FliC的鉴定第64页
    3.3.2 重组FliC蛋白的诱导表达和纯化第64-65页
    3.3.3 鼠抗FliC多克隆抗体第65页
  3.4 细菌运动性鉴定第65-67页
  3.5 透射电镜鉴定缺失株第67页
  3.6 玻板凝集鉴定缺失株中FliC和FaeG的表达第67-68页
  3.7 生长试验第68页
  3.8 黏附试验和黏附抑制试验第68-70页
  3.9 qRT-PCR第70页
  4. 讨论第70-71页
参考文献第71-74页
研究二 K88ac+产肠毒素大肠杆菌鞭毛和K88菌毛对细菌生物被膜及群体感应的影响第74-84页
  1. 材料第75-76页
  1.1 菌株与质粒第75页
  1.2 主要试剂第75-76页
  1.3 主要仪器第76页
  2. 方法第76-77页
  2.1 生物被膜定量试验第76页
  2.2 AI-2分子测定试验第76-77页
  2.3 qRT-PCR第77页
  3. 结果第77-79页
  3.1 生物被膜定量试验第77-78页
  3.2 生物发光试验检测AI-2活性第78-79页
  3.3 qRT-PCR第79页
4 讨论第79-80页
参考文献第80-84页
研究三 细胞脂筏在产肠毒素大肠杆菌鞭毛介导的肠上皮细胞促炎性反应中的作用探析第84-99页
  1. 材料第85-86页
  1.1 菌株与质粒第85-86页
  1.2 主要试剂第86页
  1.3 主要仪器第86页
  2. 方法第86-90页
  2.1 重组FliC蛋白的制备第86-87页
    2.1.1 重组FliC蛋白原核表达引物的设计和载体构建第86-87页
    2.1.2 重组FliC蛋白的原核表达和纯化第87页
  2.2 细胞培养及计数第87页
  2.3 MβCD毒性分析第87-88页
    2.3.1 不同浓度MβCD处理对肠上皮细胞的细胞毒性作用分析第87-88页
    2.3.2 不同MβCD处理时间对肠上皮细胞的细胞毒性作用分析第88页
  2.4 膜胆固醇去除效率的鉴定第88页
  2.5 qRT-PCR检测IL-8和TNF-α的表达第88-89页
    2.5.1 待测基因的引物设计第88-89页
    2.5.2 待测样品的准备和qRT-PCR第89页
    2.5.3 数据的分析和处理第89页
  2.6 ELISA检测IL-8和TNF-α的表达第89-90页
    2.6.1 待测样品的准备第89页
    2.6.2 ELISA试剂盒检测IL-8和TNF-α表达第89-90页
  3. 结果第90-95页
  3.1 重组FliC蛋白的制备第90-91页
    3.1.1 重组质粒pET28a-FliC的鉴定第90页
    3.1.2 重组FliC蛋白的诱导表达和纯化第90-91页
  3.2 MβCD毒性分析第91-93页
    3.2.1 MβCD去除膜胆固醇最佳作用浓度的选择第91-92页
    3.2.2 MβCD去除膜胆固醇最佳作用时间的选择第92-93页
  3.3 膜胆固醇去除效率的鉴定第93页
  3.4 qRT-PCR检测IL-8和TNF-α的表达第93-94页
  3.5 ELISA检测IL-8和TNF-α的表达第94-95页
  4. 讨论第95-96页
参考文献第96-99页
研究四 全基因组测序K88ac+产肠毒素大肠杆菌C83902第99-117页
  1. 材料第100-101页
  1.1 菌株与质粒第100页
  1.2 主要试剂第100-101页
  1.3 主要仪器第101页
  2. 方法第101-102页
  2.1 细菌基因组的提取第101页
  2.2 全基因组测序第101页
  2.3 基因组注释第101-102页
  2.4 其他基因元件的预测第102页
  2.5 系统进化树的构建第102页
  3. 结果第102-110页
  3.1 基因组组装评价第102页
  3.2 C83902基因组的基本特征第102-104页
  3.3 基因组功能注释第104-105页
    3.3.1 KEGG注释第104页
    3.3.2 COG数据库注释第104-105页
  3.4 CRISPR分析第105-106页
  3.5 前噬菌体分析第106-107页
  3.6 耐药基因检测第107-108页
  3.7 系统进化树第108页
  3.8 毒力因子预测和新型菌毛的发现第108-110页
  4. 讨论第110-113页
参考文献第113-117页
研究五 K88ac+产肠毒素大肠杆菌alpha菌毛的克隆、表达和鉴定第117-127页
  1. 材料第118-119页
  1.1 菌株与质粒第118页
  1.2 主要试剂第118页
  1.3 主要仪器第118-119页
  2. 方法第119-121页
  2.1 操纵子的预测和分布调查第119页
  2.2 表达载体的构建第119-120页
    2.2.1 引物设计第119-120页
    2.2.2 表达载体的构建第120页
  2.3 透射电镜鉴定Alpha菌毛第120页
  2.4 细胞黏附试验第120-121页
  3. 结果第121-125页
  3.1 Alpha菌毛操纵子的特征与分布第121-123页
  3.2 Alpha菌毛表达载体的构建第123页
  3.3 透射电镜观察alpha菌毛表达第123-125页
  4. 讨论第125页
参考文献第125-127页
全文结论第127-129页
论文创新点第129-130页
致谢第130-132页
攻读博士期间发表的学术论文第132-136页

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