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植物remorin蛋白调控水稻条纹病毒细胞间移动机制

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植物remorin蛋白调控水稻条纹病毒细胞间移动机制
论文目录
 
致谢第11-13页
摘要第13-15页
Abstract第15-18页
1 文献综述第18-67页
  1.1 水稻条纹病毒研究概述第18-30页
    1.1.1 水稻条纹病毒病的发生危害第18-19页
    1.1.2 水稻条纹病毒病的抗病育种策略第19-20页
    1.1.3 RSV基因组的结构特征第20-22页
    1.1.4 RSV基因组编码的蛋白第22-23页
    1.1.5 RSV的细胞间移动第23-24页
    1.1.6 RSV与寄主因子的互作研究第24-28页
      1.1.6.1 RSV与植物寄主因子的互作第24-26页
      1.1.6.2 RSV与传毒昆虫寄主因子的互作第26-28页
    1.1.7 RSV研究展望第28-30页
  1.2 蛋白质组学定量技术第30-36页
    1.2.1 iTRAQ技术第31-33页
      1.2.1.1 iTRAQ技术原理及流程第31-32页
      1.2.1.2 iTRAQ数据的生物信息分析第32-33页
    1.2.2 iTRAQ技术优缺点第33-34页
    1.2.3 iTRAQ技术在植物研究中的应用第34-36页
  1.3 植物remorin蛋白研究进展第36-53页
    1.3.1 Remorin蛋白的发现与命名第36-37页
    1.3.2 Remorin蛋白的进化与分类第37-40页
    1.3.3 Remorin蛋白的结构与形态第40-42页
    1.3.4 Remorin蛋白的组织表达第42-43页
    1.3.5 Remorin蛋白的定位第43-47页
    1.3.6 Remorin蛋白的生物学功能第47-53页
      1.3.6.1 Remorin蛋白与植物的非生物胁迫第48页
      1.3.6.2 Remorin蛋白与植物的生物胁迫第48-51页
      1.3.6.3 Remorin蛋白与植物的生理调控第51-53页
  1.4 植物体内棕榈酰化修饰研究概述第53-67页
    1.4.1 蛋白的棕榈酰化修饰第53-54页
    1.4.2 蛋白棕榈酰基转移酶第54-57页
    1.4.3 蛋白的去棕榈酰化修饰第57-58页
    1.4.4 棕榈酰化修饰鉴定方法第58-61页
      1.4.4.1 软件分析工具第58-59页
      1.4.4.2 生化检测方法第59-61页
    1.4.5 改变蛋白质棕榈酰化修饰程度的方法第61-62页
      1.4.5.1 棕榈酰化修饰位点突变第61页
      1.4.5.2 使用化学抑制剂第61-62页
      1.4.5.3 其它第62页
    1.4.6 植物蛋白棕榈酰化修饰与蛋白功能第62-67页
      1.4.6.1 棕榈酰化修饰与细胞膜蛋白第64-65页
      1.4.6.2 棕榈酰化修饰与蛋白蛋白间的互作第65-66页
      1.4.6.3 棕榈酰化修饰与其它类型翻译后修饰及蛋白稳定性第66-67页
2 研究结果第67-188页
  2.1 iTRAQ技术分析水稻条纹病毒侵染本氏烟差异表达蛋白第67-87页
    2.1.1 材料与方法第67-76页
      2.1.1.1 材料第67页
      2.1.1.2 RSV摩擦接毒本氏烟第67-68页
      2.1.1.3 叶片总RNA提取第68页
      2.1.1.4 RNA反转录第68-69页
      2.1.1.5 Real-time quantitative PCR第69页
      2.1.1.6 叶片总蛋白提取第69页
      2.1.1.7 蛋白电泳第69-70页
      2.1.1.8 Western blot分析第70页
      2.1.1.9 RSV接种检测第70-71页
      2.1.1.10 iTRAQ第71-73页
        2.1.1.10.1 蛋白质提取第71页
        2.1.1.10.2 蛋白质浓度测定第71-72页
        2.1.1.10.3 SDS电泳第72页
        2.1.1.10.4 蛋白质酶解第72页
        2.1.1.10.5 iTRAQ标记第72页
        2.1.1.10.6 SCX分离第72-73页
        2.1.1.10.7 基于QE的液质联用分析第73页
      2.1.1.11 生物信息分析第73-76页
    2.1.2 结果与分析第76-85页
      2.1.2.1 带毒和健康本氏烟RSV检测第76-77页
      2.1.2.2 iTRAQ技术鉴定蛋白质第77-79页
      2.1.2.3 蛋白质定量及差异蛋白GO和Pathway分析第79-81页
      2.1.2.4 差异蛋白的转录本表达分析第81-85页
    2.1.3 讨论第85-87页
  2.2 差异表达蛋白remorin负调控RSV侵染本氏烟第87-113页
    2.2.1 材料与方法第87-94页
      2.2.1.1 材料第87-88页
      2.2.1.2 TRV病毒诱导的基因沉默第88页
      2.2.1.3 Real-time quantitative PCR第88页
      2.2.1.4 生物信息学分析第88-89页
        2.2.1.4.1 基因鉴定及聚类分折第88-89页
        2.2.1.4.2 基因结构比较及同源性分析第89页
      2.2.1.5 组织特异性表达分析第89页
      2.2.1.6 转基因过表达及阳性鉴定第89页
      2.2.1.7 基于CRISPR/Cas9的基因敲除第89-91页
        2.2.1.7.1 基于CRISPR/Cas9的NbREM1.1/1.2基因敲除:第89-90页
        2.2.1.7.2 基于CRISPR/Cas9的基因敲除阳性鉴定第90-91页
      2.2.1.8 Northern印迹分析第91-93页
        2.2.1.8.1 甲醛变性凝胶电泳第91页
        2.2.1.8.2 RNA转膜第91-92页
        2.2.1.8.3 杂交第92-93页
      2.2.1.9 农杆菌瞬时浸润第93页
      2.2.1.10 RSV侵染本氏烟病情指数分析第93-94页
    2.2.2 结果与分析第94-111页
      2.2.2.1 沉默本氏烟remorin有利于RSV病毒侵染本氏烟第94-97页
      2.2.2.2 本氏烟remorin基因鉴定及聚类分析第97-98页
      2.2.2.3 NbREM1.1和NbREM1.2鉴定及基因结构分析第98-101页
      2.2.2.4 NbREM1.1和NbREM1.2组织表达分析第101-102页
      2.2.2.5 NbREM1的蛋白和转录本应答RSV侵染表达分析第102-104页
      2.2.2.6 敲除本氏烟NbREM1基因有利于RSV侵染本氏烟第104-107页
      2.2.2.7 转基因过表达NbREM1抑制RSV侵染本氏烟第107-111页
    2.2.3 讨论第111-113页
  2.3 本氏烟remorin蛋白负调控RSV胞间移动第113-129页
    2.3.1 材料与方法第113-117页
      2.3.1.1 材料第113页
      2.3.1.2 组织印记(Tissue print)分析第113-114页
      2.3.1.3 农杆菌瞬时浸润第114页
      2.3.1.4 PVX运动缺陷型病毒PVX-△P25-GFP运动回补实验第114-115页
      2.3.1.5 胞间连丝通透性分析与细胞胼胝体积累量分析第115页
      2.3.1.6 亚细胞定位分析第115-116页
      2.3.1.7 质膜分析/微流体分离第116-117页
    2.3.2 结果与分析第117-127页
      2.3.2.1 NbREM1负调控RSV侵染点病毒粒子的细胞间移动第117-119页
      2.3.2.2 NbREM1负调控NSvc4回补PVX△p25-GFP细胞间移动第119-120页
      2.3.2.3 NbREM1负调控胞间连丝通透性第120-122页
      2.3.2.4 NbREM1蛋白C端33个氨基酸是其细胞膜定位的决定因素第122-125页
      2.3.2.5 NbREM1细胞膜定位缺失突变体不能抑制病毒细胞间移动第125-127页
    2.3.3 讨论第127-129页
  2.4 本氏烟remorin蛋白的棕榈酰化修饰与其生物学功能第129-150页
    2.4.1 材料与方法第129-134页
      2.4.1.1 材料第129页
      2.4.1.2 生物素替换分析(Biotin switch assay)第129-131页
      2.4.1.3 野生型及棕榈酰化突变体的亚细胞定位分析第131-132页
      2.4.1.4 半体内蛋白质降解分析第132页
      2.4.1.5 半体内蛋白质降解抑制分析第132页
      2.4.1.6 体内蛋白质降解抑制分析第132-133页
      2.4.1.7 体内棕榈酰化修饰抑制分析第133-134页
    2.4.2 结果与分析第134-148页
      2.4.2.1 NbREM1第206位的半胱氨酸位点被棕榈酰化修饰(S-acylation)第134-135页
      2.4.2.2 NbREM1蛋白的棕榈酰化修饰有助于NbREM1细胞膜定位第135-138页
      2.4.2.3 NbREM1蛋白的棕榈酰化修饰有助于NbREM1蛋白稳定第138-141页
      2.4.2.4 棕榈酰化修饰突变体NbREM1~(C206A)进入自噬降解途径第141-145页
      2.4.2.5 棕榈酰化修饰突变体NbREM1~(C206A)不能抑制NSvc4回补PVX△P25-GFP细胞间移动第145-148页
    2.4.3 讨论第148-150页
  2.5 RSV及其运动蛋白NSvc4抑制本氏烟remorin蛋白棕榈酰化修饰并导致其降解第150-167页
    2.5.1 材料与方法第150-153页
      2.5.1.1 材料第150页
      2.5.1.2 RSV侵染早晚期应答蛋白的转录本和蛋白质表达分析第150-151页
      2.5.1.3 双分子荧光互补第151页
      2.5.1.4 分裂泛素化酵母互作第151页
      2.5.1.5 酵母转化第151-152页
      2.5.1.6 互作验证第152-153页
    2.5.2 结果与分析第153-165页
      2.5.2.1 RSV侵染干扰NbREM1的棕榈酰化导致NbREM1进入自噬降解系统第153-155页
      2.5.2.2 RSV运动蛋白NSvc4与NbREM1互作并改变NbREM1的亚细胞定位第155-160页
      2.5.2.3 NSvc4干扰NbREM1的棕榈酰化导致NbREM1进入自噬降解系统第160-163页
      2.5.2.4 NSvc4的内质网定位缺失突变体不能干扰NbREM1的棕榈酰化第163-165页
    2.5.3 讨论第165-167页
  2.6 水稻remorin抑制RSV侵染水稻第167-188页
    2.6.1 材料与方法第167-170页
      2.6.1.1 材料第167页
      2.6.1.2 基因鉴定及蛋白比对第167-168页
      2.6.1.3 转基因过表达及阳性鉴定第168页
      2.6.1.4 基于CRISPR/Cas9的OsREM1.4基因敲除第168页
      2.6.1.5 携带RSV的灰飞虱对水稻接毒实验第168-169页
      2.6.1.6 野生型及棕榈酰化突变体的亚细胞定位分析第169页
      2.6.1.7 生物素替换分析第169页
      2.6.1.8 半体内降解实验第169-170页
    2.6.2 结果与分析第170-185页
      2.6.2.1 水稻remorin基因鉴定及其棕榈酰化修饰分析第170-171页
      2.6.2.2 OsREM1.4是RSV侵染水稻的负调控因子第171-175页
      2.6.2.3 OsREM1.4负调控水稻叶片胼胝体积累第175-176页
      2.6.2.5 棕榈酰化修饰有助于OsREM1.4的细胞膜定位第176-179页
      2.6.2.6 榈酰化修饰有助于OsREM1.4的蛋白稳定性第179-184页
      2.6.2.7 NSvc4抑制OsREM1.4的棕榈酰化修饰第184-185页
    2.6.3 讨论第185-188页
3 全文总结与展望第188-196页
  3.1 鉴定RSV侵染本氏烟的差异表达蛋白第188-189页
  3.2 解答差异表达蛋白NbREM1负调控RSV侵染的分子机制第189-190页
  3.3 发现NbREM1蛋白的棕榈酰化修饰对其发挥生物学功能至关重要第190-191页
  3.4 证明了RSV能够抑制NbREM1的棕榈酰化修饰并导致其降解第191-192页
  3.5 初步确认水稻OsREM1.4负调控RSV侵染水稻第192-193页
  3.6 植物remorin蛋白与RSV的互作模型第193-195页
  3.7 不足与展望第195-196页
4 参考文献第196-206页
附录Ⅰ 本论文所用引物列表第206-212页
附录Ⅱ 本论文所用术语缩写词及中英文对照第212-216页
附录Ⅲ 本论文所用病毒缩写及中英文对照第216-217页
附录Ⅳ 常用缓冲液和培养基配方第217-223页

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