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基因枪介导的油菜叶绿体遗传转化研究

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基因枪介导的油菜叶绿体遗传转化研究
论文目录
 
摘要第1-11页
Abstract第11-14页
1 文献综述第14-38页
  1.1 植物细胞全能性与形态发生第14-16页
    1.1.1 植物细胞全能性概述第15页
    1.1.2 植物细胞离体培养下脱分化第15-16页
    1.1.3 离体组织器官发生第16页
    1.1.4 体细胞胚胎发生第16页
  1.2 植物组织培养体系中的内源和外源影响因子第16-19页
    1.2.1 内源影响因子第17-18页
      1.2.1.1 基因型第17页
      1.2.1.2 母体植株的生理状态第17页
      1.2.1.3 母体植株的生长环境第17-18页
    1.2.2 外源影响因子第18-19页
      1.2.2.1 植物激素第18页
      1.2.2.2 营养因子第18-19页
  1.3 油菜再生体系研究进展第19-25页
    1.3.1 影响油菜愈伤诱导和植株再生的因素第19-22页
      1.3.1.1 基因型第19-20页
      1.3.1.2 外植体第20-21页
      1.3.1.3 激素第21页
      1.3.1.4 培养条件第21-22页
    1.3.2 油菜组织培养再生过程中遇到的问题和应对措施第22-25页
      1.3.2.1 外植体褐化现象第22-24页
      1.3.2.2 外植体玻璃化第24-25页
  1.4 植物叶绿体基因工程研究进展第25-38页
    1.4.1 叶绿体基因工程原理第25-29页
    1.4.2 叶绿体中外源基因的整合与调控第29-31页
      1.4.2.1 同源重组片段第29页
      1.4.2.2 启动子和非翻译区第29-30页
      1.4.2.3 外源基因的积累和基因表达调控第30-31页
    1.4.3 叶绿体转基因材料的筛选第31-34页
      1.4.3.1 抗生素筛选标记基因第31-32页
      1.4.3.2 其它筛选标记基因第32-33页
      1.4.3.3 标记基因的去除第33页
      1.4.3.4 叶绿体转化植株同质化问题第33-34页
    1.4.4 叶绿体基因工程的应用第34-37页
      1.4.4.1 生物反应器第34-35页
      1.4.4.2 改良农艺性状第35-36页
      1.4.4.3 叶绿体转化技术在基础研究方面的应用第36-37页
    1.4.5 我国植物叶绿体基因工程研究现状第37-38页
2 研究目的和意义第38-39页
3 适合油菜叶绿体转化的再生体系的建立第39-50页
  3.1 材料与方法第39-43页
    3.1.1 实验材料第39页
      3.1.1.1 油菜材料第39页
      3.1.1.2 主要生化试剂第39页
      3.1.1.3 主要仪器设备第39页
    3.1.2 主要试剂和培养基配制第39-41页
      3.1.2.1 主要试剂配制第39-40页
      3.1.2.2 培养基配制第40-41页
    3.1.3 实验方法第41-42页
      3.1.3.1 技术路线第41页
      3.1.3.2 不同灭菌剂对无菌苗生长的影响第41-42页
    3.1.3 无菌苗种植第42页
      3.1.3.4 子叶和叶片愈伤组织的诱导第42页
      3.1.3.5 子叶和叶片愈伤组织的分化培养第42页
      3.1.3.6 再生苗的壮苗、春化、移栽第42页
    3.1.4 结果统计第42-43页
  3.2 结果与分析第43-50页
    3.2.1 不同灭菌剂对油菜无菌苗的影响第43页
    3.2.2 不同植物激素对愈伤组织诱导的影响第43-45页
      3.2.2.1 不同激素配比对子叶外植体愈伤组织诱导的差异第43-45页
      3.2.2.2 不同激素配比对叶片外植体愈伤组织诱导的差异第45页
    3.2.3 光照和黑暗条件下子叶愈伤组织的差异第45-47页
    3.2.4 不同植物激素对油菜愈伤组织保持脱分化状态的影响第47页
    3.2.5 不同植物激素配比对愈伤组织分化的影响第47-48页
    3.2.6 愈伤组织培养时间对分化率的影响第48-50页
4 适合上述组织培养体系的品种的筛选第50-55页
  4.1 材料与方法第50-51页
    4.1.1 实验材料第50页
      4.1.1.1 油菜材料第50页
      4.1.1.2 主要生化试剂和培养基第50页
      4.1.1.3 主要仪器设备第50页
    4.1.2 实验方法第50-51页
      4.1.2.1 无菌苗种植及叶片外植体的获得第50-51页
      4.1.2.2 愈伤组织诱导第51页
      4.1.2.3 诱导愈伤组织分化第51页
      4.1.2.4 再生苗的壮苗、春化和移栽第51页
    4.1.3 结果统计第51页
  4.2 结果与分析第51-55页
    4.2.1 FY系列油菜不同品种间再生频率差异第51-52页
    4.2.2 T系列油菜不同品种间再生频率差异第52-53页
    4.2.3 不同状态的愈伤组织比较第53页
    4.2.4 形态异常再生小苗第53-55页
5 油菜品种特异性叶绿体表达载体的构建第55-75页
  5.1 材料与方法第55-63页
    5.1.1 实验材料第55页
      5.1.1.1 细菌菌株及质粒第55页
      5.1.1.2 溶液、酶和试剂盒第55页
      5.1.1.3 主要仪器设备第55页
    5.1.2 常用试剂配制和培养基配制第55-59页
      5.1.2.1 常用试剂配制第55-56页
      5.1.2.2 质粒提取试剂第56-57页
      5.1.2.3 油菜叶绿体基因组DNA提取试剂第57页
      5.1.2.4 细菌培养所用培养基第57-58页
      5.1.2.5 所用引物第58-59页
    5.1.3 实验方法第59-63页
      5.1.3.1 提取质粒DNA第59-61页
      5.1.3.2 感受态细胞的制备及转化第61-63页
      5.1.3.3 PCR克隆基因第63页
  5.2 结果与分析第63-75页
    5.2.1 同源重组片段的克隆与分析第63-65页
      5.2.1.1 FY-4来源1.5 kb的同源片段tmI/tmA克隆第63-64页
    5.21.2 FY-4来源2.5 kb同源片段16S/tmI和tmA/23S克隆第64页
      5.2.1.3 T13来源1.5 kb同源片段rbcL/accD的克隆第64-65页
    5.2.2 调控原件克隆第65-66页
      5.2.2.1 叶绿体特异性启动子Prrn和终止子TpsbA克隆第65-66页
      5.2.2.2 T7 g10L和gfp部分序列的SOE-PCR克隆第66页
    5.2.3 相关基因的克隆与分析第66-67页
      5.2.3.1 筛选标记基因aadA的克隆第66页
      5.2.3.2 人血清白蛋白基因HSA克隆第66-67页
    5.2.4 不同构建形式的油菜品种特异性转化载体的构建第67-75页
      5.2.4.1 pCL318-5转化载体的构建第67-70页
      5.2.4.2 pCL1013-8转化载体的构建第70页
      5.2.4.3 pCL1031-F4转化载体的构建第70-75页
6 基因枪介导的油菜叶绿体转化体系的研究第75-103页
  6.1 材料与方法第75-88页
    6.1.1 实验材料第75页
      6.1.1.1 油菜材料第75页
      6.1.1.2 质粒DNA第75页
      6.1.1.3 主要生化试剂第75页
      6.1.1.4 主要仪器设备第75页
    6.1.2 培养基和主要试剂配制第75-78页
      6.1.2.1 油菜叶绿体转化及筛选所需培养基第75页
      6.1.2.2 基因枪轰击相关试剂第75-76页
      6.1.2.3 油菜基因组DNA提取试剂第76-77页
      6.1.2.4 Southern杂交相关试剂第77-78页
      6.1.2.5 Northern杂交相关试剂第78页
    6.1.3 实验方法第78-88页
      6.1.3.1 油菜无菌苗的获得第78-79页
      6.1.3.2 子叶或叶片的高渗培养第79页
      6.1.3.3 基因枪轰击油菜子叶(只轰击金粉)实验第79页
      6.1.3.4 基因枪转化油菜子叶或叶片第79-80页
      6.1.3.5 转化后子叶或叶片的恢复培养第80页
      6.1.3.6 子叶或叶片外植体愈伤组织诱导及筛选第80页
      6.1.3.7 愈伤组织分化筛选第80-81页
      6.1.3.8 FY-4和T15绿色抗性苗的生根、壮苗、春化和移栽第81页
      6.1.3.9 CTAB法提取油菜基因组DNA第81-82页
      6.1.3.10 不同引物PCR鉴定抗性苗第82页
      6.1.3.11 Southern杂交分析第82-85页
      6.1.3.12 油菜总RNA的提取第85-86页
      6.1.3.13 Northern杂交分析第86-88页
      6.1.3.14 FY-4叶绿体转基因植株的后代鉴定第88页
    6.1.4 结果统计第88页
  6.2 结果与分析第88-103页
    6.2.1 基因枪轰击/不轰击对叶片外植体的损伤分析第88-90页
    6.2.2 以油菜FY-4子叶为外植体的叶绿体转化植株的获得及鉴定第90-97页
      6.2.2.1 基因枪轰击子叶外植体、筛选及转化植株的获得第90-91页
      6.2.2.2 筛选过程中出现的嵌合体小苗第91-92页
      6.2.2.3 FY-4叶绿体转基因植株T0代PCR鉴定第92-93页
      6.2.2.4 FY-4阳性植株不同探针的Southern杂交鉴定第93-94页
      6.2.2.5 FY-4 Southern杂交阳性植株的Northern杂交鉴定第94-95页
      6.2.2.6 FY-4转基因植株的后代鉴定第95-97页
    6.2.3 以叶片为外植体的T15油菜品种叶绿体转化植株的获得第97-99页
      6.2.3.1 基因枪轰击T15叶片、筛选及转化植株的获得第97-99页
      6.2.3.2 T15叶绿体转基因植株T0代PCR鉴定第99页
    6.2.4 不同筛选方法对外植体筛选及转化的的影响第99-101页
      6.2.4.1 不同筛选方法对外植体出愈率、褐化率和白化率的影响第99-100页
      6.2.4.2 不同筛选方案得到的绿色愈伤数和阳性苗数比较第100-101页
    6.2.5 不同长度同源片段及不同构建形式的转化载体对转化的影响第101-102页
    6.2.6 绿色抗性苗的再次脱分化筛选第102-103页
7 讨论第103-109页
  7.1 适合油菜叶绿体转化的组织培养体系的建立第103-105页
  7.2 油菜品种特异性叶绿体转化载体的构建第105-106页
  7.3 油菜叶绿体转基因植株的获得第106-107页
  7.4 叶绿体转基因植株的分子鉴定第107-109页
8 参考文献第109-122页
致谢第122-123页
附录第123页

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