论文目录 | |
| 中文摘要 | 第1-5页 |
| 英文摘要 | 第5-13页 |
| 缩略词 | 第13-14页 |
| 1 绪论 | 第14-32页 |
| 1.1 引言 | 第14-16页 |
| 1.2 昆虫病原真菌侵染机理研究进展 | 第16-20页 |
| 1.2.1 昆虫病原真菌绿僵菌对寄主体壁的穿透机制 | 第16-18页 |
| 1.2.2 昆虫病原真菌抵御昆虫免疫的研究进展 | 第18-20页 |
| 1.3 筛选差异表达基因的研究进展 | 第20-23页 |
| 1.3.1 基因芯片技术 (gene chip technology) | 第20页 |
| 1.3.2 抑制消减杂交技术（SSH） | 第20-21页 |
| 1.3.3 mRNA差异显示技术 | 第21-22页 |
| 1.3.4 大规模测序技术 | 第22-23页 |
| 1.4 真菌遗传转化的研究进展 | 第23-25页 |
| 1.4.1 原生质体-PEG（polyethylene glycol）介导转化法 | 第23页 |
| 1.4.2 电激转化法(Electroporation) | 第23页 |
| 1.4.3 基因枪转化法(Biolistics) | 第23-24页 |
| 1.4.4 限制性内切酶介导转化法 | 第24页 |
| 1.4.5 PEG/LiCl介导的芽生孢子的转化 | 第24页 |
| 1.4.6 农杆菌介导转化法 | 第24-25页 |
| 1.5 毒力相关基因的研究进展 | 第25-30页 |
| 1.5.1 与脂肪酸代谢相关的酶 | 第25页 |
| 1.5.2 脂酶和酯酶 | 第25-26页 |
| 1.5.3 真菌降解利用寄主表皮的烃类物质的酶 | 第26页 |
| 1.5.4 磷脂酶C基因 | 第26-27页 |
| 1.5.5 逃避宿主免疫的基因 | 第27页 |
| 1.5.6 脂肪酸脱氢酶基因 | 第27-30页 |
| 1.6 技术路线 | 第30-32页 |
| 2 利用差异显示技术研究莱氏野村菌侵染斜纹夜蛾血淋巴不同时期差异表达基因 | 第32-56页 |
| 2.1 试验材料 | 第32-36页 |
| 2.1.1 试验验菌株 | 第32页 |
| 2.1.2 试验器材 | 第32-33页 |
| 2.1.3 试验药品、试剂及生产厂家 | 第33页 |
| 2.1.4 常用培养基与试剂的配制 | 第33-34页 |
| 2.1.5 差异显示所用的引物 | 第34-36页 |
| 2.1.6 技术路线 | 第36页 |
| 2.2 试验方法 | 第36-46页 |
| 2.2.1 莱氏野村菌CQNr01孢悬液的制备 | 第36页 |
| 2.2.2 莱氏野村菌CQNr01侵染斜纹夜蛾血淋巴后不同时期虫菌体的获得 | 第36-37页 |
| 2.2.3 昆虫血淋巴中血细胞的处理及虫菌体的收集 | 第37页 |
| 2.2.4 莱氏野村菌菌体总RNA提取 | 第37-38页 |
| 2.2.5 1%琼脂糖电泳检测 | 第38页 |
| 2.2.6 DNase I消化总RNA中混杂的gDNA | 第38-39页 |
| 2.2.7 逆转录反应 | 第39页 |
| 2.2.8 利用内参基因PCR扩增确定DNase消化效率及cDNA合成效率 | 第39页 |
| 2.2.9 DD-RT-PCR | 第39-42页 |
| 2.2.10 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第42-43页 |
| 2.2.11 差异条带的回收及再扩增 | 第43页 |
| 2.2.12 PCR产物回收 | 第43-44页 |
| 2.2.13 纯化产物与载体的连接 | 第44页 |
| 2.2.14 转化 | 第44-45页 |
| 2.2.15 阳性克隆子的筛选与测序 | 第45页 |
| 2.2.16 差异条带测序结果的生物信息学分析 | 第45页 |
| 2.2.17 差异表达序列的q-RT-PCR检测 | 第45页 |
| 2.2.18 RT-qPCR用到的引物 | 第45-46页 |
| 2.2.19 RT-qPCR结果分析 | 第46页 |
| 2.2.20 差异显示结果与转录组数据库的比对分析 | 第46页 |
| 2.3 结果与分析 | 第46-53页 |
| 2.3.1 莱氏野村菌在斜纹夜蛾体内的发育进程 | 第46-47页 |
| 2.3.2 莱氏野村菌虫菌体的分离 | 第47-48页 |
| 2.3.3 gDNA的污染情况及cDNA合成的效率检测 | 第48页 |
| 2.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳寻找差异表达条带 | 第48-49页 |
| 2.3.5 差异表达序列BlastX比对与转录组序列比对结果 | 第49-53页 |
| 2.3.6 差异表达序列的q-RT-PCR检测 | 第53页 |
| 2.4 讨论 | 第53-56页 |
| 3 莱氏野村菌侵染进程相关基因的克隆 | 第56-78页 |
| 3.1 试验材料 | 第56-59页 |
| 3.1.1 试验验菌株 | 第56页 |
| 3.1.2 试验器材 | 第56页 |
| 3.1.3 试验药品、试剂及生产厂家 | 第56页 |
| 3.1.4 常用培养基与试剂的配制 | 第56-59页 |
| 3.2 试验方法 | 第59-64页 |
| 3.2.1 莱氏野村菌虫菌体总RNA提取 | 第59页 |
| 3.2.2 逆转录反应 | 第59-60页 |
| 3.2.3 利用内参基因PCR扩增确定DNase消化效率及cDNA合成效率 | 第60页 |
| 3.2.4 5’RACE | 第60-62页 |
| 3.2.5 FPNI-PCR扩增基因侧翼序列 | 第62-64页 |
| 3.2.6 基因的生物信息学分析 | 第64页 |
| 3.3 试验结果及分析 | 第64-75页 |
| 3.3.1 5’RACE | 第64-65页 |
| 3.3.2 NrFADS2基因组DNA序列的获得 | 第65-67页 |
| 3.3.3 NrFADS2基因的生物信息学分析 | 第67-75页 |
| 3.4 讨论 | 第75-78页 |
| 4 根癌农杆菌介导的莱氏野村菌遗传转化体系的建立 | 第78-114页 |
| 4.1 试验材料 | 第78-81页 |
| 4.1.1 试验菌株 | 第78页 |
| 4.1.2 主要试剂、仪器和设备 | 第78页 |
| 4.1.3 主要培养基及试剂 | 第78-79页 |
| 4.1.4 试验中所用的引物 | 第79-81页 |
| 4.2 试验方法 | 第81-96页 |
| 4.2.1 莱氏野村菌芽生孢子的Hygromycin B敏感性试验 | 第81页 |
| 4.2.2 重叠延伸PCR：SOE-PCR | 第81-82页 |
| 4.2.3 PCR产物回收 | 第82页 |
| 4.2.4 纯化产物与载体的连接 | 第82页 |
| 4.2.5 大肠杆菌的热激转化 | 第82页 |
| 4.2.6 大肠杆菌质粒的小量抽提法 | 第82-83页 |
| 4.2.7 质粒DNA或PCR片段的限制性内切酶酶切 | 第83-84页 |
| 4.2.8 表达载体构成元件融合片段的的扩增 | 第84页 |
| 4.2.9 表达载体的构建策略及流程 | 第84-88页 |
| 4.2.10 农杆菌菌株的感受态细胞的制备 | 第88-89页 |
| 4.2.11 冻融法将表达载体导入农杆菌菌株 | 第89页 |
| 4.2.12 根癌农杆菌介导莱氏野村菌的遗传转化 | 第89-90页 |
| 4.2.13 莱氏野村菌转化子的继代筛选 | 第90页 |
| 4.2.14 真菌基因组DNA小量提取 | 第90页 |
| 4.2.15 莱氏野村菌的基因组DNA CTAB法纯化抽提 | 第90-91页 |
| 4.2.16 莱氏野村菌转化子的gDNA PCR检测 | 第91页 |
| 4.2.17 潮霉素抗性转化子的Southern杂交检测 | 第91-95页 |
| 4.2.18 转化子的突变表型分析 | 第95页 |
| 4.2.19 激光共聚焦显微镜观察转化子红色荧光蛋白的表达 | 第95-96页 |
| 4.2.20 随机插入转化子T-DNA侧翼序列的扩增及序列分析 | 第96页 |
| 4.3 试验结果 | 第96-111页 |
| 4.3.1 芽生孢子的获得与显微镜观察 | 第96页 |
| 4.3.2 莱氏野村菌对Hygromycin B的敏感性试验 | 第96-97页 |
| 4.3.3 表达载体构建 | 第97-102页 |
| 4.3.4 潮霉素抗性转化子的获得 | 第102-103页 |
| 4.3.5 莱氏野村菌潮霉素抗性转化子的PCR检测 | 第103-105页 |
| 4.3.6 杂交探针浓度的确定 | 第105页 |
| 4.3.7 Southern杂交验证莱氏野村菌 | 第105-106页 |
| 4.3.8 转化子的突变表型分析 | 第106-108页 |
| 4.3.9 红色荧光蛋白DsRED2基因在莱氏野村菌中表达 | 第108-110页 |
| 4.3.10 四种不同农杆菌菌株对莱氏野村菌转化效率的比较 | 第110页 |
| 4.3.11 随机插入突变转化子T-DNA插入位点侧翼序列分析 | 第110-111页 |
| 4.4 讨论 | 第111-114页 |
| 5 莱氏野村菌基因敲除、回复体系的建立及NrFADS2基因的功能鉴定 | 第114-136页 |
| 5.1 试验材料 | 第114页 |
| 5.1.1 试验菌株 | 第114页 |
| 5.1.2 主要试剂、仪器和设备 | 第114页 |
| 5.1.3 主要培养基及试剂 | 第114页 |
| 5.1.4 试验中所用的引物 | 第114页 |
| 5.2 试验方法 | 第114-120页 |
| 5.2.1 NrFADS2基因敲除表达载体的构建 | 第114-115页 |
| 5.2.2 NrFADS2基因敲除载体的PCR及酶切验证 | 第115页 |
| 5.2.3 农杆菌介导的莱氏野村菌的遗传转化 | 第115-116页 |
| 5.2.4 无需gDNA提取的快速PCR检测 | 第116页 |
| 5.2.5 莱氏野村菌芽生孢子的诺尔斯菌素（Nourseothricin）敏感性试验 | 第116-117页 |
| 5.2.6 NrFADS2基因回复载体的构建 | 第117-118页 |
| 5.2.7 野生型与敲除转化子之间在不同培养条件下的生长特性比较 | 第118页 |
| 5.2.8 菌株抗氧化能力测定 | 第118页 |
| 5.2.9 菌株抗逆境能力测定 | 第118-119页 |
| 5.2.10 菌株抗紫外能力测定 | 第119页 |
| 5.2.11 生物毒力测定 | 第119-120页 |
| 5.3 试验结果 | 第120-133页 |
| 5.3.1 NrFADS2基因侧翼片段的扩增 | 第120页 |
| 5.3.2 NrFADS2基因侧翼片段及敲除载体的PCR及酶切验证 | 第120-121页 |
| 5.3.3 NrFADS2基因敲除转化子的筛选及鉴定 | 第121-123页 |
| 5.3.4 敲除NrFADS2基因影响菌株对于脂肪酸的利用 | 第123-124页 |
| 5.3.5 莱氏野村菌芽生孢子诺尔斯菌素（Nourseothricin）抑菌浓度的确定 | 第124页 |
| 5.3.6 回复载体pZP-Ptrpc-SAT1-knock的PCR及酶切验证 | 第124-125页 |
| 5.3.7 NrFADS2基因回复载体pZP-Ptrpc-SAT1-FAD-CP的构建 | 第125-126页 |
| 5.3.8 回复转化子的获得 | 第126-127页 |
| 5.3.9 敲除NrFADS2基因影响菌株抗氧化能力 | 第127-128页 |
| 5.3.10 敲除NrFADS2基因影响细胞壁的组成的完整性 | 第128-130页 |
| 5.3.11 敲除NrFADS2基因影响莱氏野村菌的抗紫外线能力 | 第130-131页 |
| 5.3.12 敲除NrFADS2基因影响莱氏野村菌对斜纹夜蛾的毒力 | 第131-133页 |
| 5.4 讨论 | 第133-136页 |
| 6 主要结论与后续工作建议 | 第136-138页 |
| 6.1 主要结论 | 第136页 |
| 6.2 创新点 | 第136-137页 |
| 6.3 后续工作建议 | 第137-138页 |
| 致谢 | 第138-140页 |
| 参考文献 | 第140-152页 |
| 附录 | 第152页 |
| A. 作者在攻读博士学位期间发表的论文的情况 | 第152页 |
| B. 作者在攻读博士学位期间参加的科研课题 | 第152页 |
