论文目录 | |
| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-13页 |
| 第1章文献综述 | 第13-26页 |
| 1.1 PKR研究概况 | 第13-14页 |
| 1.1.1 PKR属于丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族 | 第13-14页 |
| 1.1.2 PKR又属于RNA结合蛋白家族 | 第14页 |
| 1.2 PKR的分子结构 | 第14-15页 |
| 1.3 PKR的激酶活性的活化与抑制 | 第15-19页 |
| 1.3.1 PKR的激酶活性活化的分子机制 | 第15-16页 |
| 1.3.2 RNA对PKR的激活作用 | 第16页 |
| 1.3.3 RNA对PKR的抑制作用 | 第16-17页 |
| 1.3.4 蛋白质对PKR的激活作用 | 第17页 |
| 1.3.5 蛋白质对PKR的抑制作用 | 第17-18页 |
| 1.3.6 其他物质对PKR的调节作用 | 第18-19页 |
| 1.4 PKR的生物学活性 | 第19-21页 |
| 1.4.1 PKR的抗病毒活性 | 第19页 |
| 1.4.2 PKR是一个认知衰退的标志分子 | 第19页 |
| 1.4.3 PKR可以调节细胞内众多的信号通路 | 第19-21页 |
| 1.5 抗病毒免疫反应中PKR活化与细胞因子蛋白翻译的矛盾 | 第21-23页 |
| 1.5.1 PKR与细胞非特异免疫反应 | 第21页 |
| 1.5.2 PKR激活后细胞蛋白翻译的一个问题 | 第21-22页 |
| 1.5.3 PKR激活后细胞蛋白翻译的可能途径 | 第22-23页 |
| 1.5.4 不依赖PKR的dsRNA活化NF-κB途径 | 第23页 |
| 1.6 鱼类PKR的研究进展 | 第23-24页 |
| 1.7 本研究目的、意义 | 第24-26页 |
| 1.7.1 本研究目的 | 第24-25页 |
| 1.7.2 本研究意义 | 第25-26页 |
| 第2章 材料与方法 | 第26-58页 |
| 2.1 仪器与试剂 | 第26-31页 |
| 2.1.1 主要仪器设备 | 第26-27页 |
| 2.1.2 主要试剂与试剂盒 | 第27-28页 |
| 2.1.3 质粒载体与菌种 | 第28页 |
| 2.1.4 引物表 | 第28-31页 |
| 2.2 实验材料 | 第31页 |
| 2.3 相关软件 | 第31页 |
| 2.4 CiPKR基因及蛋白结构分析 | 第31-33页 |
| 2.4.1 CiPKR的N端的三个dsRBM数据库检索分析 | 第31页 |
| 2.4.2 CiPKR的N端的三个dsRBM的系统进化分析 | 第31-32页 |
| 2.4.3 CiPKR的N端的三个dsRBM的氨基酸序列中的保守序列分析 | 第32页 |
| 2.4.4 CiPKR的N端的三个dsRBM空间结构的模拟分析 | 第32-33页 |
| 2.5 CiPKR-ORF的扩增 | 第33-35页 |
| 2.5.1 草鱼肾细胞(CIK cell)的培养 | 第33页 |
| 2.5.2 草鱼出血病毒(GCHV)的紫外线灭活 | 第33页 |
| 2.5.3 CIK细胞的GCHV刺激 | 第33页 |
| 2.5.4 CIK细胞RNA提取及cDNA反转录合成 | 第33-35页 |
| 2.6 重叠PCR(Over-lapping PCR)引物设计 | 第35页 |
| 2.7 CiPKR的N端dsRBD突变体二聚化实验及结合PolyI:C实验 | 第35-41页 |
| 2.7.1 原核表达的CiPKR的N端dsRBD突变体的构建 | 第36-37页 |
| 2.7.2 CiPKR的N端dsRBD突变体的原核表达和蛋白纯化 | 第37-39页 |
| 2.7.3 CiPKR的N端dsRBD突变体的二聚化实验 | 第39-40页 |
| 2.7.4 CiPKR的N端的dsRBD突变体的PolyI:C Pull-down实验 | 第40页 |
| 2.7.5 CiPKR的N端的dsRBM突变体的琼脂糖凝胶阻滞实验 | 第40-41页 |
| 2.8 CiPKR突变体抑制荧光素酶合成的功能研究 | 第41-43页 |
| 2.8.1 真核表达的CiPKR突变体的构建 | 第41-42页 |
| 2.8.2 真核表达CiPKR突变体转染CIK细胞实验 | 第42-43页 |
| 2.8.3 转染CiPKR突变体后CIK细胞蛋白提取 | 第43页 |
| 2.8.4 提取蛋白的荧光素酶活性测定 | 第43页 |
| 2.9 转染CiPKR突变体对CIK细胞活力的影响 | 第43-44页 |
| 2.9.1 细胞计数 | 第44页 |
| 2.9.2 MTT实验 | 第44页 |
| 2.9.3 CCK-8 实验 | 第44页 |
| 2.10 CiPKR的底物CieIF2α 的克隆 | 第44-47页 |
| 2.10.1 CieIF2α 的同源克隆 | 第44-45页 |
| 2.10.2 CieIF2α 的 3′-RACE | 第45-46页 |
| 2.10.3 CieIF2α 的 5′-RACE | 第46页 |
| 2.10.4 CieIF2α 的全长的拼接 | 第46页 |
| 2.10.5 CieIF2A的克隆 | 第46-47页 |
| 2.11 CiPKR、CieIF2α 和CieIF2α-like的原核表达和多克隆抗体制备 | 第47-49页 |
| 2.11.1 CiPKR、CieIF2α 和CieIF2α-like的原核表达的构建 | 第47页 |
| 2.11.2 CiPKR、CieIF2α 和CieIF2α-like的原核表达和蛋白纯化 | 第47-48页 |
| 2.11.3 CiPKR、CieIF2α 和CieIF2α-like纯化蛋白浓度测定 | 第48页 |
| 2.11.4 CiPKR、CieIF2α 和CieIF2α-like免疫大白兔 | 第48-49页 |
| 2.11.5 CiPKR、CieIF2α 和CieIF2α-like的多克隆抗体效能检测 | 第49页 |
| 2.12 GCHV刺激CIK细胞后CiPKR转录表达分析 | 第49-51页 |
| 2.12.1 CIK细胞GCHV刺激 | 第49页 |
| 2.12.2 CIK细胞GCHV刺激后RNA提取和cDNA反转 | 第49页 |
| 2.12.3 Q-PCR检测CiPKR, CieIF2α, CieIF2A的转录表达 | 第49-51页 |
| 2.13 CIK细胞的CiPKR敲降(knock-down) | 第51-56页 |
| 2.13.1 CiPKR的siRNA设计 | 第51-52页 |
| 2.13.2 带荧光基团的siRNA转染实验 | 第52页 |
| 2.13.3 MTT检测CIK细胞转染siRNA后的细胞活力 | 第52-53页 |
| 2.13.4 CIK细胞CiPKR敲降后Poly I:C刺激 | 第53页 |
| 2.13.5 刺激后敲降的CIK细胞蛋白提取 | 第53-54页 |
| 2.13.6 Q-PCR检测CiPKR敲降后CiIFN及CiISG转录表达 | 第54页 |
| 2.13.7 WB检测CiIFN及CiPKR表达水平 | 第54-56页 |
| 2.14 2-AP刺激CIK细胞后对CiPKR表达的影响 | 第56-57页 |
| 2.15 CQ刺激CIK细胞后对CiPKR表达的影响 | 第57-58页 |
| 第3章 结果与分析 | 第58-93页 |
| 3.1 CiPKR分子结构的生物信息学分析 | 第58-62页 |
| 3.1.1 多个在线生物软件分析CiPKR的N端的dsRBD含有3个dsRBM | 第58-59页 |
| 3.1.2 CiPKR的N端的3个dsRBM的系统进化分析 | 第59-60页 |
| 3.1.3 CiPKR的N端的3个dsRBM的氨基酸序列的保守区域比对 | 第60-61页 |
| 3.1.4 CiPKR的N端的3个dsRBM空间结构的分子模拟 | 第61-62页 |
| 3.2 CiPKR的N端的3个dsRBM的原核表达和体外功能分析 | 第62-67页 |
| 3.2.1 CIK细胞总RNA提取与CiPKR基因ORF的扩增 | 第62页 |
| 3.2.2 CiPKR的N端的dsRBM原核表达的构建 | 第62-63页 |
| 3.2.3 CiPKR的N端的dsRBM和C端原核表达 | 第63页 |
| 3.2.4 原核表达的CiPKR的N端的dsRBM和C端的二聚化 | 第63-65页 |
| 3.2.5 Poly I:C对CiPKR的dsRBM的Pulldown | 第65-66页 |
| 3.2.6 CiPKR的dsRBM对Poly I:C电泳的阻滞 | 第66-67页 |
| 3.3 含不同的dsRBM的CiPKR突变体的抑制蛋白作用 | 第67-73页 |
| 3.3.1 真核表达的含不同的dsRBM的CiPKR突变体构建的设计 | 第67-68页 |
| 3.3.2 真核表达的含不同的dsRBM的CiPKR突变体构建 | 第68-69页 |
| 3.3.3 含不同dsRBM的CiPKR突变体对荧光素酶表达的抑制作用 | 第69-70页 |
| 3.3.4 含不同dsRBM的CiPKR突变体对CIK细胞活力的影响 | 第70-73页 |
| 3.4 CieIF2α，CieIF2α-like和CieIF2A基因的克隆 | 第73-83页 |
| 3.4.1 CieIF2α 与CieIF2α-like的克隆 | 第73-76页 |
| 3.4.2 CieIF2α 和CieIF2α-like的序列比对 | 第76-80页 |
| 3.4.3 CieIF2α 和CieIF2α-like的系统进化分析 | 第80-81页 |
| 3.4.4 CieIF2A的同源克隆 | 第81-83页 |
| 3.5 CiPKR,CieIF2α,CieIF2α-like原核表达构建和多克隆抗体制备 | 第83-84页 |
| 3.5.1 CiPKR、CieIF2α 和CieIF2α-like原核表达和抗体制备 | 第83页 |
| 3.5.2 CiPKR、CieIF2α 和CieIF2α-like抗体效价和特异性检测 | 第83-84页 |
| 3.6 GCHV刺激CIK细胞后CiPKR、CieIF2α、CieIF2A转录表达分析 | 第84-86页 |
| 3.7 CiPKR敲降后CiPKR，CiIFN和CiMX的转录表达分析 | 第86-90页 |
| 3.8 CiPKR敲降后CiPKR、CiIFN的蛋白表达分析 | 第90-91页 |
| 3.9 2-AP和CQ对GCHV刺激CIK细胞CiPKR、CiIFN转录表达的影响 | 第91-93页 |
| 第4章 讨论 | 第93-105页 |
| 4.1 CiPKR的N端的3个dsRBM的鉴定 | 第93-95页 |
| 4.2 三个dsRBM对CiPKR功能的影响 | 第95-96页 |
| 4.3 CiPKR活化机制 | 第96-98页 |
| 4.4 CieIF2α、CieIF2α-like和CieIF2A的克隆和转录表达分析 | 第98-100页 |
| 4.5 CiPKR在抗病毒免疫反应中的功能分析 | 第100-102页 |
| 4.6 CiPKR与CiIFN的相互作用关系分析 | 第102-105页 |
| 第5章 主要结论、创新点及研究展望 | 第105-107页 |
| 参考文献 | 第107-119页 |
| 致谢 | 第119-120页 |
| 附录1 缩略语 | 第120-122页 |
| 附录2 贴壁细胞或悬浮细胞接种数量及培养基体积 | 第122-123页 |
| 附录3 不同的细胞培养板转染si RNA的推荐转染条件 | 第123-124页 |
| 附录4 发表论文 | 第124页 |
