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高致病性PRRSV双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的研制及基因工程疫苗的研究

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高致病性PRRSV双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的研制及基因工程疫苗的研究
论文目录
 
摘要第11-12页
Abstract第12-15页
缩略语表(Abbreviation)第15-17页
第1章 文献综述第17-30页
  1.1 猪繁殖与呼吸综合征第17页
  1.2 PRRS的流行病学特点第17-18页
  1.3 PRRSV的病原特性第18-19页
    1.3.1 病毒的分类及特性第18页
    1.3.2 PRRSV的生物学特性第18-19页
  1.4 PRRSV分子生物学第19-24页
    1.4.1 基因组的基本结构第19-20页
    1.4.2 PRRSV的蛋白质第20-23页
    1.4.3 PRRSV的遗传变异第23-24页
  1.5 PRRS的诊断研究第24-26页
    1.5.1 病毒分离第25页
    1.5.2 分子生物学检测方法第25页
    1.5.3 血清学诊断方法第25-26页
  1.6 PRRSV的免疫学反应第26-28页
    1.6.1 体液免疫反应第26-27页
    1.6.2 细胞免疫反应第27-28页
  1.7 PRRS疫苗研究进展第28-30页
    1.7.1 PRRS传统常规疫苗第28页
    1.7.2 PRRS新型疫苗研究进展第28-30页
第2章 高致病性PRRSV双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的研制第30-74页
  2.1 材料第30-35页
    2.1.1 毒株、细胞与菌株第30-31页
    2.1.2 载体和质粒第31-32页
    2.1.3 抗体、酶和相关试剂第32页
    2.1.4 培养基与抗生素及其配制第32-33页
    2.1.5 主要缓冲液与相关试剂及其配制第33-35页
    2.1.6 实验动物第35页
  2.2 方法第35-49页
    2.2.1 细胞培养和病毒增殖第35页
    2.2.2 病毒RNA的提取第35-36页
    2.2.3 cDNA的合成第36页
    2.2.4 ORF7基因的扩增第36-37页
    2.2.5 限制性内切酶酶切反应第37页
    2.2.6 PCR产物或酶切产物的电泳检测第37页
    2.2.7 PCR产物或酶切产物的回收与纯化第37-38页
    2.2.8 外源DNA片段与质粒载体的连接反应第38页
    2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)第38-39页
    2.2.10 连接产物的转化第39页
    2.2.11 质粒的小量制备第39-40页
    2.2.12 诱导表达第40页
    2.2.13 SDS-PAGE电泳第40页
    2.2.14 Western blot检测分析第40-41页
    2.2.15 免疫原的制备第41页
    2.2.16 免疫程序第41页
    2.2.17 SP2/0骨髓瘤细胞的活化第41-42页
    2.2.18 SP2/0骨髓瘤细胞的制备第42页
    2.2.19 免疫脾细胞的制备第42页
    2.2.20 饲养细胞的制备第42-43页
    2.2.21 细胞融合第43页
    2.2.22 阳性杂交瘤细胞的筛选第43-44页
    2.2.23 杂交瘤细胞的克隆化第44页
    2.2.24 单克隆抗体的生产第44页
    2.2.25 单克隆抗体特性的鉴定第44-45页
    2.2.26 单克隆抗体的纯化第45页
    2.2.27 标准阴、阳性对照的制备第45页
    2.2.28 双抗体夹心ELISA检测方法条件的优化第45-46页
    2.2.29 单抗包被板的制备第46页
    2.2.30 单抗与PRRSV经典毒株和变异毒株反应性的研究第46-47页
    2.2.31 特异性检验第47页
    2.2.32 敏感性检验第47页
    2.2.33 重复性检验第47页
    2.2.34 符合率检验第47页
    2.2.35 试剂盒的稳定性检测第47-48页
    2.2.36 人工接种动物的抗原消长规律的研究第48-49页
  2.3 结果与分析第49-70页
    2.3.1 PRRSV ORF7基因的RT-PCR结果第49-50页
    2.3.2 原核表达质粒的构建第50页
    2.3.3 重组N蛋白的原核表达第50-51页
    2.3.4 Western Blotting检测第51-52页
    2.3.5 免疫原的制备第52页
    2.3.6 细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选第52-53页
    2.3.7 单抗腹水的制备第53页
    2.3.8 单抗效价的测定第53页
    2.3.9 单抗与PRRSV的反应性研究第53-54页
    2.3.10 单抗亚类的鉴定第54页
    2.3.11 单抗的纯化第54页
    2.3.12 包被抗体和酶标记物的选择第54-55页
    2.3.13 方阵滴定确定包被抗体和酶标记物的浓度第55-56页
    2.3.14 抗原和包被单抗最佳反应时间的确定第56页
    2.3.15 酶标记物与抗原最佳反应时间的确定第56-57页
    2.3.16 底物液最佳反应时间的确定第57页
    2.3.17 临界值的确定第57-60页
    2.3.18 ELISA操作程序的确定第60-61页
    2.3.19 经典毒株和变异毒株的检测第61-62页
    2.3.20 特异性检测第62-63页
    2.3.21 敏感性检测第63-64页
    2.3.22 重复性检测第64-66页
    2.3.23 符合率检测第66-68页
    2.3.24 稳定性检测第68-69页
    2.3.25 人工感染动物的抗原消长规律的研究第69-70页
  2.4 讨论第70-73页
    2.4.1 ORF7基因的原核表达第70-71页
    2.4.2 抗PRRSV N蛋白单克隆抗体的制备第71页
    2.4.3 双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的研制第71-73页
  2.5 小结第73-74页
第3章 伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒(rPRV-PRRSV)重组基因工程疫苗的研究第74-115页
  3.1 材料第75-84页
    3.1.1 毒株、细胞与菌株第75页
    3.1.2 载体和质粒第75-78页
    3.1.3 抗体、酶和相关试剂第78-79页
    3.1.4 培养基与抗生素及其配制第79-80页
    3.1.5 免疫反应试验所用抗原及血清第80页
    3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制第80-84页
    3.1.7 实验动物第84页
  3.2 方法第84-98页
    3.2.1 细胞培养和病毒增殖第84页
    3.2.2 感染病毒的细胞样品总RNA的提取第84-85页
    3.2.3 总cDNA的合成及各个基因的PCR扩增第85页
    3.2.4 限制性内切酶酶切反应第85页
    3.2.5 PCR产物或酶切产物的电泳检测第85-86页
    3.2.6 线性质粒DNA末端去磷酸化第86页
    3.2.7 PCR产物或酶切产物的回收与纯化第86页
    3.2.8 外源DNA片段与质粒载体的连接反应第86-87页
    3.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)第87页
    3.2.10 连接产物的转化第87页
    3.2.11 质粒的制备与鉴定第87-88页
    3.2.12 重组伪狂犬病毒(PRV)基因组DNA的提取第88-89页
    3.2.13 脂质体共转染法第89-90页
    3.2.14 重组病毒的空斑纯化第90-91页
    3.2.15 PCR检测目的外源基因在重组病毒中的整合第91页
    3.2.16 Southern blot印迹分析第91-92页
    3.2.17 Western blot检测目的蛋白在真核细胞中的表达第92-93页
    3.2.18 GP5-ELISA试验第93页
    3.2.19 半数细胞培养物感染量(TCID50)的测定第93页
    3.2.20 微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)第93-94页
    3.2.21 构建重组杆状病毒的操作流程及示意图第94页
    3.2.22 重组穿梭载体(Bacmid)的构建第94-95页
    3.2.23 重组穿梭载体(Bacmid)的提取第95页
    3.2.24 重组杆状病毒获得及毒价测定第95页
    3.2.25 重组杆状病毒转导哺乳动物细胞第95页
    3.2.26 小鼠脾淋巴细胞的制备第95-96页
    3.2.27 样品总RNA的提取及cDNA的合成第96页
    3.2.28 SYBR Green Ⅰ实时定量PCR第96-97页
    3.2.29 相对mRNA表达水平的计算第97页
    3.2.30 IFN-γ的定量检测(双抗体夹心ELISA)第97页
    3.2.31 动物实验第97-98页
    3.2.32 统计学方法第98页
  3.3 结果与分析第98-112页
    3.3.1 转移质粒pgG-CMV-EGFP的构建第98-99页
    3.3.2 转移质粒pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut的构建第99-100页
    3.3.3 转移质粒pgG-CMV-ORF545-2m的构建第100-103页
    3.3.4 重组病毒的构建与纯化第103-106页
    3.3.5 重组病毒的Southern杂交鉴定第106-107页
    3.3.6 重组病毒的Western blot鉴定第107-108页
    3.3.7 免疫小鼠抗PRV特异性抗体的检测第108-109页
    3.3.8 免疫小鼠特异性针对PRRSV GP5的ELISA抗体第109-110页
    3.3.9 免疫小鼠特异性针对PRRSV的中和抗体第110页
    3.3.10 ELISA方法分析免疫小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ水平第110-111页
    3.3.11 实时荧光定量PCR检测小鼠脾细胞中IFN-γ mRNA表达第111-112页
  3.4 讨论第112-114页
  3.5 小结第114-115页
第4章 杆状病毒表达系统介导的高致病性猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗研究第115-125页
  4.1 材料第115页
  4.2 方法第115页
  4.3 结果与分析第115-122页
    4.3.1 转移质粒pFastBac-CMV-3456的构建第115-117页
    4.3.2 重组Bacmid-CMV-3456的构建第117页
    4.3.3 重组杆状病毒BV-CMV-3456的获得第117页
    4.3.4 外源基因在哺乳动物细胞内的转录与表达第117-118页
    4.3.5 重组病毒的纯化与毒价测定第118-119页
    4.3.6 免疫小鼠的ELISA抗体水平第119-120页
    4.3.7 免疫小鼠的中和抗体水平检测第120页
    4.3.8 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γ mRNA表达第120-122页
    4.3.9 免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-γ水平分析第122页
  4.4 讨论第122-124页
  4.5 小结第124-125页
参考文献第125-143页
致谢第143-144页
附录第144页

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