论文目录 | |
| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-18页 |
| 第一章 综述 | 第18-35页 |
| 1 新城疫病毒磷蛋白相关研究概况 | 第18-20页 |
| 2 单链抗体的应用前景 | 第20-23页 |
| 3 胞内抗体及其应用研究进展 | 第23-29页 |
| 4 胞质转导肽当前研究现状 | 第29-32页 |
| 5 问题与展望 | 第32-33页 |
| 6 本研究的目的和意义 | 第33-34页 |
| 7 本研究的总体实验思路及技术路线 | 第34-35页 |
| 第二章 鸡源性抗新城疫病毒单链抗体库的构建 | 第35-66页 |
| 第一节NDV scFv基因表达文库的构建 | 第35-51页 |
| 1 材料 | 第37-38页 |
| 1.1 实验动物、菌株和质粒 | 第37页 |
| 1.2 主要试剂 | 第37-38页 |
| 1.3 主要仪器 | 第38页 |
| 2 实验方法 | 第38-46页 |
| 2.1 三黄鸡的免疫及阴性、阳性血清的制备 | 第38页 |
| 2.2 总RNA的提取 | 第38-40页 |
| 2.3 鸡源性单链抗体库基因的构建 | 第40-42页 |
| 2.4 单链抗体原核表达质粒的构建 | 第42-43页 |
| 2.5 单链抗体表达抗体库的构建 | 第43-44页 |
| 2.6 重组质粒pOPE101-XP-scFv的诱导表达 | 第44页 |
| 2.7 重组质粒pOPE101-XP-scFv原核表达产物可溶性分析 | 第44-45页 |
| 2.8 重组质粒pOPE101-XP-scFv诱导表达分析 | 第45-46页 |
| 3 结果 | 第46-51页 |
| 3.1 VH、VL基因的扩增 | 第46页 |
| 3.2 单链抗体基因的扩增 | 第46页 |
| 3.3 重组质粒pOPE101-XP-scFv的鉴定 | 第46页 |
| 3.4 鸡源性单链抗体库库容量与库多样性的评价 | 第46-47页 |
| 3.5 单链抗体阳性克隆的检测 | 第47-48页 |
| 3.6 重组质粒pOPE101-XP-scFv诱导表达条件的优化 | 第48-50页 |
| 3.7 重组质粒pOPE101-XP-scFv原核表达产物的纯化 | 第50-51页 |
| 4 小结 | 第51页 |
| 第二节 抗新城疫病毒单链抗体的筛选及鉴定 | 第51-64页 |
| 1 实验材料 | 第52页 |
| 1.1 毒株及鸡胚 | 第52页 |
| 1.2 主要试剂及耗材 | 第52页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第52页 |
| 2 实验方法 | 第52-57页 |
| 2.1 NDV F48E9病毒的纯化 | 第52-53页 |
| 2.2 间接ELISA筛选方法的建立 | 第53-54页 |
| 2.3 ELISA筛选条件的优化 | 第54-55页 |
| 2.4 单链抗体特异性实验 | 第55页 |
| 2.5 单链抗体阳性克隆序列分析比较 | 第55页 |
| 2.6 单链抗体的性质测定 | 第55-56页 |
| 2.7 单链抗体阳性克隆体外中和活性分析 | 第56-57页 |
| 3 实验结果 | 第57-64页 |
| 3.1 新城疫病毒抗原的纯化鉴定 | 第57页 |
| 3.2 筛选方法的建立与优化 | 第57-59页 |
| 3.3 抗新城疫病毒单链抗体的筛选 | 第59-60页 |
| 3.4 单链抗体阳性克隆序列分析 | 第60-61页 |
| 3.5 单链抗体的生物学特性分析 | 第61-62页 |
| 3.6 单链抗体阳性克隆对NDV感染细胞的保护效果 | 第62-64页 |
| 4 小结 | 第64页 |
| 第三节 讨论 | 第64-66页 |
| 第三章 鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白单链抗体筛选 | 第66-89页 |
| 第一节 新城疫病毒磷蛋白的原核表达及纯化 | 第66-80页 |
| 1 材料 | 第67-68页 |
| 1.1 病毒、菌株和质粒 | 第67页 |
| 1.2 主要试剂 | 第67-68页 |
| 1.3 主要仪器 | 第68页 |
| 2 实验方法 | 第68-75页 |
| 2.1 磷蛋白表达基因的扩增、纯化和回收 | 第68-70页 |
| 2.2 磷蛋白表达基因的克隆 | 第70-71页 |
| 2.3 pET-28a-P融合蛋白基因的构建 | 第71-73页 |
| 2.4 NDV磷蛋白的抗原表位预测 | 第73页 |
| 2.5 重组质粒pET-28a-P诱导表达的鉴定 | 第73页 |
| 2.6 重组质粒pET-28a-P诱导原核表达条件的优化 | 第73-74页 |
| 2.7 重组质粒pET-28a-P原核表达产物的纯化及鉴定 | 第74-75页 |
| 3 结果 | 第75-80页 |
| 3.1 NDV F48E9磷蛋白表达基因的PCR扩增结果 | 第75-76页 |
| 3.2 NDV F48E9磷蛋白表达基因的克隆与酶切鉴定 | 第76页 |
| 3.3 NDV F48E9磷蛋白表达基因测序结果及核苷酸和氨基酸序列分析 | 第76-77页 |
| 3.4 重组表达质粒pET-28a-P原核表达的鉴定 | 第77-78页 |
| 3.5 重组质粒pET-28a-P原核表达产物诱导表达条件的优化 | 第78-80页 |
| 3.6 重组质粒pET-28a-P原核表达产物诱导表达的纯化 | 第80页 |
| 4 小结 | 第80页 |
| 第二节 抗新城疫病毒磷蛋白单链抗体的筛选 | 第80-87页 |
| 1 实验材料 | 第81-82页 |
| 1.1 病毒、菌株和质粒 | 第81页 |
| 1.2 主要试剂及耗材 | 第81页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第81-82页 |
| 2 实验方法 | 第82-83页 |
| 2.1 间接ELISA筛选方法的建立 | 第82页 |
| 2.2 单链抗体阳性克隆序列分析比较 | 第82-83页 |
| 2.3 单链抗体的亲和力测定分析 | 第83页 |
| 2.4 Western blot分析新城疫病毒磷蛋白与单链抗体的结合 | 第83页 |
| 3 实验结果 | 第83-86页 |
| 3.1 抗新城疫病毒磷蛋白单链抗体阳性克隆的获得 | 第83-84页 |
| 3.2 抗新城疫病毒磷蛋白单链抗体阳性克隆的序列分析 | 第84-85页 |
| 3.3 单链抗体阳性克隆亲和力分析结果 | 第85-86页 |
| 3.4 单链抗体与新城疫病毒磷蛋白的结合能力 | 第86页 |
| 4 小结 | 第86-87页 |
| 第三节 讨论 | 第87-89页 |
| 第四章 鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体研制及生物活性分析 | 第89-111页 |
| 第一节 抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体的研制 | 第89-100页 |
| 1 材料 | 第90-91页 |
| 1.1 病毒、菌株、质粒和细胞 | 第90页 |
| 1.2 主要试剂 | 第90-91页 |
| 1.3 主要仪器 | 第91页 |
| 2 实验方法 | 第91-97页 |
| 2.1 抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体基因的扩增 | 第91-93页 |
| 2.2 胞内抗体重组质粒的转染 | 第93-94页 |
| 2.3 RT-PCR检测抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体mRNA的表达 | 第94-95页 |
| 2.4 重组质粒转染细胞的表达检测 | 第95-97页 |
| 2.5 流式细胞仪检测两种融合蛋白诱导BHK21细胞凋亡分析 | 第97页 |
| 3 实验结果 | 第97-100页 |
| 3.1 重组质粒的构建与鉴定 | 第97-98页 |
| 3.2 抗鸡新城疫病毒磷蛋白胞内抗体在BHK21细胞中的表达分析 | 第98-99页 |
| 3.3 Western blot检测胞内抗体的表达 | 第99页 |
| 3.4 流式细胞仪对两种融合蛋白的检测分析 | 第99-100页 |
| 4 小结 | 第100页 |
| 第二节 抗磷蛋白胞内抗体生物活性分析 | 第100-109页 |
| 1 材料 | 第102页 |
| 1.1 病毒和质粒 | 第102页 |
| 1.2 主要试剂 | 第102页 |
| 1.3 主要仪器 | 第102页 |
| 2 实验方法 | 第102-105页 |
| 2.1 激光共聚焦观察胞内抗体在细胞定位 | 第102-103页 |
| 2.2 免疫共沉淀实验分析胞内抗体与磷蛋白的结合活性 | 第103页 |
| 2.3 抗鸡新城疫病毒磷蛋白胞内抗体对病毒的影响 | 第103页 |
| 2.4 实时定量荧光PCR检测胞内抗体对病毒的抑制效果 | 第103-105页 |
| 3 实验结果 | 第105-108页 |
| 3.1 重组质粒pCDNA3.1-scFv-17和pCDNA3.1-scFv-103细胞内表达及定位分析 | 第105-106页 |
| 3.2 Western blot | 第106-107页 |
| 3.3 HA检测胞内抗体对NDV感染细胞的保护效果 | 第107页 |
| 3.4 抗鸡新城疫病毒磷蛋白胞内抗体对病毒复制及转录的影响 | 第107-108页 |
| 4 小结 | 第108-109页 |
| 第三节 讨论 | 第109-111页 |
| 第五章 鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白穿膜性胞内抗体研制及生物学活性研究 | 第111-135页 |
| 第一节 穿膜抗体的构建及在E.coli中的表达 | 第112-123页 |
| 1 材料 | 第112-113页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第112页 |
| 1.2 主要生化试剂 | 第112-113页 |
| 1.3 主要仪器 | 第113页 |
| 2 实验方法 | 第113-118页 |
| 2.1 穿膜抗体基因的PCR扩增、纯化及回收 | 第113-114页 |
| 2.2 穿膜抗体基因的克隆 | 第114页 |
| 2.3 穿膜抗体重组质粒pET-28a-scFv-CTP的构建 | 第114-115页 |
| 2.4 重组质粒pET-28a-scFv-CTP的诱导表达及鉴定 | 第115-116页 |
| 2.5 重组质粒pET-28a-scFv-CTP原核表达条件的优化 | 第116页 |
| 2.6 重组质粒pET-28a-scFv-CTP原核表达产物的可溶性分析 | 第116-117页 |
| 2.7 重组质粒pET-28a-scFv-CTP原核表达产物的纯化 | 第117-118页 |
| 2.8 穿膜抗体蛋白包涵体的复性 | 第118页 |
| 2.9 重组质粒pET-28a-scFv-CTP原核表达产物的表达分析 | 第118页 |
| 3 结果 | 第118-123页 |
| 3.1 pET-28a-scFv-CTP基因的PCR扩增结果 | 第118页 |
| 3.2 pET-28a-scFv-CTP基因的克隆与酶切鉴定 | 第118-119页 |
| 3.3 pET-28a-scFv-CTP基因测序分析 | 第119页 |
| 3.4 重组质粒pET-28a-scFv-CTP原核表达的鉴定 | 第119-120页 |
| 3.5 重组质粒pET-28a-scFv-CTP原核表达产物诱导表达条件的优化 | 第120-121页 |
| 3.6 重组质粒pET-28a-scFv-CTP诱导表达的可溶性分析 | 第121-122页 |
| 3.7 重组质粒pET-28a-scFv-CTP诱导表达蛋白的纯化 | 第122页 |
| 3.8 重组质粒pET-28a-scFv-CTP的表达分析 | 第122-123页 |
| 4 小结 | 第123页 |
| 第二节 穿膜抗体融合蛋白穿膜活性研究 | 第123-132页 |
| 1 材料 | 第123-124页 |
| 1.1 病毒、菌株和质粒 | 第123-124页 |
| 1.2 主要试剂 | 第124页 |
| 1.3 主要仪器 | 第124页 |
| 2 实验方法 | 第124-127页 |
| 2.1 检测穿膜抗体融合蛋白进入细胞的最佳浓度 | 第124-125页 |
| 2.2 免疫荧光检测穿膜抗体融合蛋白在细胞中的定位 | 第125-126页 |
| 2.3 MTT法检测穿膜抗体融合蛋白对细胞活性影响 | 第126页 |
| 2.4 TCID50检测穿膜抗体融合蛋白对细胞的保护效果 | 第126-127页 |
| 2.5 荧光定量PCR实验检测穿膜抗体融合蛋白对新城疫病毒复制及转录的影响 | 第127页 |
| 3 实验结果 | 第127-132页 |
| 3.1 穿膜抗体穿透细胞膜最佳浓度的确定 | 第127-128页 |
| 3.2 检测穿膜抗体融合蛋白在细胞内的定位 | 第128页 |
| 3.3 穿膜抗体融合蛋白对细胞毒性的测定 | 第128-129页 |
| 3.4 穿膜抗体融合蛋白对细胞保护效果的测定 | 第129-130页 |
| 3.5 穿膜抗体融合蛋白对病毒复制及转录的影响 | 第130-132页 |
| 4 小结 | 第132页 |
| 第三节 讨论 | 第132-135页 |
| 全文结论 | 第135-136页 |
| 参考文献 | 第136-147页 |
| 致谢 | 第147-148页 |
| 攻读博士学位期间的论文及申请的专利 | 第148-151页 |
