论文目录 | |
| 摘要 | 第11-15页 |
| Abstract | 第15-19页 |
| 第一部分 文献综述 | 第19-37页 |
| 1 单核细胞增生李斯特菌的毒力因子与感染机制 | 第21-27页 |
| 1.1 单增李斯特菌主要毒力因子及感染过程 | 第23-25页 |
| 1.2 李斯特菌引起的宿主的免疫 | 第25-27页 |
| 2 斑马鱼作为实验动物模型的应用 | 第27-35页 |
| 2.1 斑马鱼胚胎发育过程 | 第28-30页 |
| 2.2 斑马鱼免疫系统 | 第30-31页 |
| 2.3 斑马鱼感染模型研究进展 | 第31-34页 |
| 2.4 无菌动物模型应用现状 | 第34-35页 |
| 3 本研究拟解决科学问题和试验方案 | 第35-37页 |
| 第二部分 试验研究 | 第37-113页 |
| 第一章 斑马鱼胚胎的无菌培养及评价 | 第39-47页 |
| 1 材料与方法 | 第40-43页 |
| 1.1 实验动物及培养条件 | 第40-41页 |
| 1.2 主要试剂及仪器 | 第41-42页 |
| 1.3 斑马鱼胚胎的无菌检验 | 第42-43页 |
| 1.4 斑马鱼胚胎TLRs分子转录水平qPCR检测 | 第43页 |
| 2 结果 | 第43-45页 |
| 2.1 斑马鱼胚胎无菌培养系统 | 第43-44页 |
| 2.2 无菌斑马鱼胚胎及其生长环境中未检出能形成菌落的微生物 | 第44页 |
| 2.3 无菌斑马鱼胚胎先天免疫未被激活 | 第44-45页 |
| 3 讨论 | 第45-47页 |
| 第二章 单增李斯特菌不同感染途径对斑马鱼致病性 | 第47-75页 |
| 第一节 卵黄注射感染李斯特菌对斑马鱼胚胎存活和孵化的影响 | 第47-55页 |
| 1 材料与方法 | 第48-52页 |
| 1.1 菌株及培养条件 | 第48页 |
| 1.2 实验动物及培养条件 | 第48页 |
| 1.3 主要试剂及仪器 | 第48-49页 |
| 1.4 GFP菌株构建 | 第49-51页 |
| 1.5 卵黄注射 | 第51-52页 |
| 1.6 斑马鱼孵化率试验 | 第52页 |
| 2 结果 | 第52-55页 |
| 2.1 GFP表达质粒的鉴定 | 第52页 |
| 2.2 表达GFP李斯特菌的筛选 | 第52页 |
| 2.3 卵黄注射能够引起斑马鱼快速死亡 | 第52-54页 |
| 2.4 卵黄注射感染李斯特菌不同菌株后的孵化率比较 | 第54-55页 |
| 第二节 脑室注射李斯特菌引起无菌斑马鱼巨噬细胞向脑内迁移 | 第55-60页 |
| 1 材料与方法 | 第56-58页 |
| 1.1 菌株及培养条件 | 第56页 |
| 1.2 实验动物及培养条件 | 第56页 |
| 1.3 主要试剂及仪器 | 第56页 |
| 1.4 斑马鱼脑室注射 | 第56-57页 |
| 1.5 斑马鱼存活试验 | 第57页 |
| 1.6 斑马鱼活体共聚焦显微镜观察 | 第57-58页 |
| 2 结果 | 第58-60页 |
| 2.1 脑室注射感染李斯特菌不同菌株后的存活率比较 | 第58页 |
| 2.2 脑室注射能够引起巨噬细胞向脑内迁移 | 第58-60页 |
| 第三节 静脉注射李斯特菌对无菌斑马鱼致病性与细菌的毒力及感染量有关 | 第60-66页 |
| 1 材料与方法 | 第61-63页 |
| 1.1 菌株及培养条件 | 第61页 |
| 1.2 实验动物及培养条件 | 第61页 |
| 1.3 主要试剂及仪器 | 第61页 |
| 1.4 斑马鱼静脉注射 | 第61-62页 |
| 1.5 斑马鱼存活试验 | 第62页 |
| 1.6 斑马鱼体内细菌计数 | 第62-63页 |
| 1.7 斑马鱼活体共聚焦显微镜观察 | 第63页 |
| 2 结果 | 第63-66页 |
| 2.1 静脉注射细菌量与致死率相关 | 第63页 |
| 2.2 脑室注射感染李斯特菌不同菌株后的存活率比较 | 第63页 |
| 2.3 李斯特菌不同菌株在于体内的增殖情况比较 | 第63-64页 |
| 2.4 单增李斯特菌在鱼体内分布情况 | 第64-66页 |
| 第四节 浸泡感染李斯特菌能引起无菌斑马鱼先天免疫基因上调 | 第66-72页 |
| 1 材料与方法 | 第67-70页 |
| 1.1 菌株及培养条件 | 第67页 |
| 1.2 实验动物及培养条件 | 第67页 |
| 1.3 主要试剂及仪器 | 第67页 |
| 1.4 斑马鱼浸泡试验 | 第67-68页 |
| 1.5 冰冻切片观察斑马鱼体内细菌 | 第68页 |
| 1.6 荧光定量PCR检测斑马鱼免疫相关基因 | 第68-70页 |
| 2 结果 | 第70-72页 |
| 2.1 浸泡感染不能引起斑马鱼死亡 | 第70页 |
| 2.2 浸泡感染细菌滞留在斑马鱼肠腔内 | 第70页 |
| 2.3 浸泡感染能引起斑马鱼免疫相关基因显著上调 | 第70-72页 |
| 第五节 讨论 | 第72-75页 |
| 第三章 致病性与非致病性李斯特菌浸泡感染斑马鱼幼鱼的比较转录组学分析 | 第75-87页 |
| 1 材料与方法 | 第76-80页 |
| 1.1 菌株及培养条件 | 第76页 |
| 1.2 实验动物及培养条件 | 第76页 |
| 1.3 主要试剂及仪器 | 第76页 |
| 1.4 RNA提取 | 第76-77页 |
| 1.5 基因芯片杂交 | 第77-78页 |
| 1.6 差异表达基因比较 | 第78页 |
| 1.7 荧光定量验证 | 第78页 |
| 1.8 Gene Ontology分析 | 第78-80页 |
| 1.9 Gene Cluster分析 | 第80页 |
| 2 结果 | 第80-85页 |
| 2.1 RNA质量鉴定 | 第80-81页 |
| 2.2 差异表达基因分析 | 第81-82页 |
| 2.3 荧光定量PCR验证 | 第82页 |
| 2.4 差异表达基因及其功能分析 | 第82-83页 |
| 2.5 免疫相关基因差异表达的聚类分析 | 第83-85页 |
| 3 讨论 | 第85-87页 |
| 第四章 Mmp-9在无菌斑马鱼抗李斯特菌感染中的作用机制探索 | 第87-113页 |
| 第一节 Mmp-9重组蛋白多克隆抗体制备 | 第87-96页 |
| 1 材料与方法 | 第88-93页 |
| 1.1 菌株、质粒及实验动物培养条件 | 第88页 |
| 1.2 主要试剂及仪器 | 第88页 |
| 1.3 生物信息学分析 | 第88-89页 |
| 1.4 重组表达质粒构建 | 第89页 |
| 1.5 Mmp-9蛋白表达纯化及多抗制备 | 第89-93页 |
| 2 结果 | 第93-96页 |
| 2.1 不同物种Mmp-9同源性比较 | 第93页 |
| 2.2 重组表达质粒的鉴定 | 第93页 |
| 2.3 重组Mmp-9的表达及纯化 | 第93-94页 |
| 2.4 Mmp-9多抗效价测定及免疫印迹 | 第94-96页 |
| 第二节 Mmp-9在无菌斑马鱼抗李斯特菌感染中的作用 | 第96-102页 |
| 1 材料与方法 | 第97-98页 |
| 1.1 菌株及培养条件 | 第97页 |
| 1.2 实验动物及培养条件 | 第97页 |
| 1.3 主要试剂及仪器 | 第97页 |
| 1.4 Morpholino抑制浓度优化 | 第97-98页 |
| 1.5 斑马鱼活体共聚焦显微镜观察 | 第98页 |
| 1.6 斑马鱼存活试验 | 第98页 |
| 1.7 斑马鱼体内细菌计数 | 第98页 |
| 1.8 斑马鱼冰冻切片观察 | 第98页 |
| 2 结果 | 第98-102页 |
| 2.1 Morpholino抑制效果检测 | 第98-99页 |
| 2.2 Mmp-9抑制使迁移至脑室巨噬细胞显著减少 | 第99-100页 |
| 2.3 Mmp-9抑制导致鱼静脉注射感染后更早死亡 | 第100-101页 |
| 2.4 Mmp-9抑制导致鱼浸泡感染后消化道出血 | 第101-102页 |
| 第三节 Mmp-9在小鼠巨噬细胞中的作用分析 | 第102-111页 |
| 1 材料与方法 | 第103-107页 |
| 1.1 菌株及培养条件 | 第103页 |
| 1.2 细胞及培养条件 | 第103页 |
| 1.3 Transwell细胞迁移试验 | 第103-104页 |
| 1.4 RNAi条件优化 | 第104-105页 |
| 1.5 细胞吞噬能力试验 | 第105页 |
| 1.6 间接免疫荧光 | 第105-106页 |
| 1.7 扫描电镜观察 | 第106页 |
| 1.8 RhoA通路药物作用 | 第106-107页 |
| 2 结果 | 第107-111页 |
| 2.1 RNAi效果分析 | 第107页 |
| 2.2 单增李斯特菌感染或LPS刺激细胞能引起Mmp-9上调 | 第107-109页 |
| 2.3 Mmp-9沉默显著抑制细胞的跨膜迁移 | 第109页 |
| 2.4 Mmp-9沉默不影响细胞吞噬细菌的能力 | 第109页 |
| 2.5 Mmp-9沉默不影响细菌周边及侧端肌动蛋白聚集 | 第109页 |
| 2.6 Mmp-9沉默不影响细胞伪足形成 | 第109-110页 |
| 2.7 抑制RhoA通路能减少因Mmp-9高表达引起的细胞迁移 | 第110-111页 |
| 第四节 讨论 | 第111-113页 |
| 全文结论 | 第113-115页 |
| 创新点 | 第115-117页 |
| 展望 | 第117-119页 |
| 参考文献 | 第119-133页 |
| 致谢 | 第133-135页 |
| 附录 | 第135-137页 |
| 主要名词缩写 | 第135-137页 |
| 作者简介 | 第137-139页 |
| 攻读博士期间科研成果 | 第139-141页 |
| 附表 | 第141-161页 |
