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宿主hnRNPC2在A型流感病毒感染过程中的作用机制研究

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宿主hnRNPC2在A型流感病毒感染过程中的作用机制研究
论文目录
 
摘要第11-15页
Abstract第15-19页
论文创新点第19-20页
研究意义第20-21页
技术路线第21-22页
第一部分 文献综述第22-44页
第一章 A型流感病毒研究进展第22-37页
1 A型流感病毒基因组结构及各蛋白功能研究进展第23-34页
  1.1 碱性聚合酶蛋白2(Basic Polymerase protein 2,PB2)第24-25页
  1.2 碱性聚合酶蛋白1(Basic Polymerase protein 1,PB1)第25页
  1.3 酸性聚合酶蛋白(Acidic Polymerase protein,PA)第25-26页
  1.4 血凝素(Hemagglutinin,HA)第26-28页
    1.4.1 HA的一级结构第26-27页
    1.4.2 HA的三维结构第27页
    1.4.3 HA的细胞受体结合位点第27-28页
  1.5 神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)第28页
  1.6 核蛋白(Nucleoprotein,NP)第28-29页
  1.7 基质蛋白(Matrix protein,M)第29页
  1.8 非结构蛋白(nonstructural protein,NS)第29-33页
    1.8.1 NS1可与多种宿主蛋白发生相互作用第30页
    1.8.2 NS1与宿主的天然免疫反应第30-31页
    1.8.3 NS1效应域的二聚化影响病毒复制及其毒力第31页
    1.8.4 NS1调节第8节段mRNA的剪切第31-32页
    1.8.5 过表达NS1对流感病毒特异性RNA和蛋白质合成的影响第32-33页
      1.8.5.1 瞬时调节病毒RNA合成第32页
      1.8.5.2 选择性翻译病毒mRNA第32-33页
  1.9 新发现的病毒蛋白第33-34页
2 流感病毒的复制第34-37页
  2.1 流感病毒的复制周期第34-36页
    2.1.1 流感病毒的吸附、侵入和脱壳第34-35页
    2.1.2 病毒基因组的复制、转录和翻译第35页
    2.1.3 病毒颗粒的组装和释放第35-36页
  2.2 流感病毒的异常复制和缺损病毒的形成第36-37页
第二章 核不均一核蛋白家族及其成员研究进展第37-44页
1 核不均一核蛋白第37-40页
  1.1 A/B蛋白第37-38页
  1.2 C1/C2蛋白第38页
  1.3 I蛋白第38页
  1.4 K/J蛋白第38-39页
  1.5 L蛋白第39页
  1.6 U蛋白第39页
  1.7 其它核不均一核蛋白第39-40页
2 hnRNP C1/C2的结构与功能简介第40-43页
  2.1 hnRNP C1/C2的结构第40-42页
  2.2 hnRNP C1/C2的功能第42-43页
3 hnRNP C1/C2可与多种病毒蛋白发生相互作用第43-44页
第二部分 研究内容第44-107页
第一章 H5N9亚型流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析第44-57页
1 材料第45页
  1.1 样本、细胞和鸡胚第45页
2 实验方法第45-47页
  2.1 样本收集第45-46页
  2.2 RNA抽提和二代测序第46页
  2.3 病毒的分离与鉴定第46页
  2.4 HA受体结合试验第46-47页
  2.5 数据分析第47页
3 结果第47-54页
  3.1 不同亚型流感病毒混合感染第47-48页
  3.2 H5N9亚型流感病毒的基因组多样性第48-52页
  3.3 H5N9亚型流感病毒的分子特征第52-54页
  3.4 H5N9病毒的受体结合特性第54页
4 讨论第54-57页
第二章 宿主hnRNP C2与A型流感病毒NS1的相互作用关系研究第57-84页
1 材料第58-59页
  1.1 毒株、菌株、细胞和鸡胚第58页
  1.2 载体、试剂和抗体第58-59页
  1.3 主要仪器与耗材第59页
2 实验方法第59-72页
  2.1 病毒基因组RNA的抽提及cDNA第一链的合成第59-61页
  2.2 感受态细胞的制备第61页
  2.3 DNA片段的回收第61页
  2.4 目的片段与载体的双酶切和连接第61-62页
  2.5 转化第62页
  2.6 不同亚型流感病毒NS1基因真核表达载体的构建第62-63页
  2.7 A/Chicken/Yuhang/1/2013(H5N9)毒株NS1基因不同截短体的构建第63-64页
  2.8 不同标签hnRNP C2真核表达载体的构建第64-65页
  2.9 hnRNP C2精细定位不同截短体的构建第65-66页
  2.10 病毒感染与激光共聚焦实验第66页
  2.11 免疫共沉淀实验(Co-IP)第66-67页
  2.12 GST Pull-Down试验第67-70页
  2.13 RNA结合蛋白免疫共沉淀试验(RNA-IP)第70-72页
    2.13.1 裂解物的制备第70页
    2.13.2 免疫共沉淀磁珠的准备第70页
    2.13.3 免疫共沉淀第70-71页
    2.13.4 RNA的纯化第71-72页
3 结果第72-82页
  3.1 宿主hnRNPC2与A型流感病毒不同亚型NS1蛋白的定位情况第72-73页
  3.2 A型流感病毒不同亚型NS1基因与hnRNP C2的相互作用研究第73-75页
  3.3 hnRNPC2互作区域的精细定位研究第75-76页
  3.4 A/Chicken/Yuhang/1/2013(H5N9)-NS1基因互作区域的精细定位研究第76-77页
  3.5 NS1与hnRNP C2的互作需要RNA的参与第77页
  3.6 依赖于RNA互作的拯救实验第77-78页
  3.7 GST Pull-Down试验结果分析第78-79页
  3.8 RNA结合蛋白免疫共沉淀试验结果分析第79-80页
  3.9 NS1蛋白互作区域关键氨基酸位点分析第80-82页
4 讨论第82-84页
第三章 A型流感病毒8质粒反向遗传操作系统的建立及突变体病毒的拯救第84-97页
1 材料第87页
  1.1 毒株、菌株、细胞和鸡胚第87页
  1.2 载体、试剂、抗体和仪器第87页
2 实验方法第87-91页
  2.1 反向遗传重组技术第87-88页
  2.2 单点、多点及缺失突变体反向遗传载体的构建第88-90页
    2.2.1 定点突变引物设计第88-89页
    2.2.2 基因定点突变反应第89-90页
    2.2.3 Dpn I消化第90页
    2.2.4 转化、挑单克隆鉴定第90页
  2.3 病毒感染的HA效价及TCID_(50)的测定第90-91页
    2.3.1 HA效价的测定第90-91页
    2.3.2 TCID_(50)的测定第91页
3 结果第91-96页
  3.1 8质粒反向遗传操作系统的构建第91-92页
  3.2 带有不同突变位点重组病毒的拯救第92-93页
  3.3 重组病毒感染情况下的Co-IP试验第93-94页
  3.4 重组病毒的病毒滴度测定第94-96页
4 讨论第96-97页
第四章 宿主hnRNP C2在A型流感病毒感染过程中的功能研究第97-107页
1 材料第97-98页
  1.1 毒株、菌株和细胞第97页
  1.2 载体、试剂、抗体和仪器第97-98页
2 实验方法第98-102页
  2.1 A/Chicken/Yuhang/1/2013(H5N9)毒株感染情况下hnRNP C1/C2变化的测定第98页
  2.2 Flag-hnRNP C2的过表达试验第98-99页
  2.3 hnRNP C2有效干扰载体的设计与筛选及RNAi细胞系的构建第99-102页
    2.3.1 Oligo DNA的设计与合成第99-100页
    2.3.2 shRNA载体的构建与筛选第100-101页
    2.3.3 慢病毒介导的shRNA干扰细胞系的构建第101-102页
  2.4 hnRNP C2的干扰试验第102页
3 结果第102-106页
  3.1 过表达Flag-hnRNP C2可抑制H5N9病毒基因组RNA的复制、转录和病毒蛋白的翻译第102-103页
  3.2 有效干扰shRNA的筛选及干扰细胞系的构建第103-104页
  3.3 hnRNP C2敲低后可促进H5N9病毒基因组RNA的复制、转录和病毒蛋白的翻译第104-106页
  3.4 病毒感染情况下hnRNP C1/C2的变化情况第106页
4 讨论第106-107页
全文总结第107-110页
参考文献第110-127页
第三部分 附录第127-139页
附录1 本文所涉及到的引物及重组质粒第127-129页
附录2 全文缩略语第129-131页
附录3 常用缓冲液及配方第131-138页
附录4 攻读博士学位期间学术成果第138-139页
致谢第139页

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