论文目录 | |
| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-36页 |
| 引言 | 第13-14页 |
| 1.1 TGF-b超家族对卵泡发育的影响 | 第14-23页 |
| 1.1.1 配体 | 第14-15页 |
| 1.1.2 受体 | 第15-17页 |
| 1.1.3 TGF-b超家族的信号传递 | 第17-18页 |
| 1.1.4 TGF-b超家族的活性调节 | 第18-20页 |
| 1.1.5 BMP15和GDF9对卵泡发育的影响 | 第20-23页 |
| 1.2 基因编辑 | 第23-28页 |
| 1.2.1 人工核酸酶对基因组的编辑 | 第24-26页 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9发展史 | 第26-27页 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9的功能 | 第27-28页 |
| 1.2.4 CRISPR/Cas9基因编辑的原理 | 第28页 |
| 1.3 DNA断裂修复途径的选择 | 第28-35页 |
| 1.3.1 DSB的产生 | 第29页 |
| 1.3.2 DSB的修复途径 | 第29-31页 |
| 1.3.3 染色体介导的调控DSB修复途径选择 | 第31页 |
| 1.3.4 53BP1促进NEHJ | 第31-32页 |
| 1.3.5 BRCA1抑制53BP1依赖性的NHEJ,促进HR | 第32-33页 |
| 1.3.6 细胞周期调控DSB末端的切割和修复途径的选择 | 第33页 |
| 1.3.7 染色体结构调控DSB修复途径 | 第33-34页 |
| 1.3.8 组蛋白抑制剂对DNA修复关键蛋白的影响 | 第34-35页 |
| 1.4 展望 | 第35-36页 |
| 第二章 水牛BMP15和GDF9克隆及卵泡发生相关基因在卵巢发育各时期的表达规律研究 | 第36-46页 |
| 2.1 材料与方法 | 第36-37页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第37页 |
| 2.2 实验方法 | 第37-40页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第37-38页 |
| 2.2.2 基因组和总RNA提取 | 第38页 |
| 2.2.3 PCR、RT-PCR和qPCR | 第38-39页 |
| 2.2.4 感受态制备及转化 | 第39-40页 |
| 2.2.5 PCR产物回收、克隆及测序 | 第40页 |
| 2.2.6 蛋白结构的预测 | 第40页 |
| 2.3 实验结果 | 第40-44页 |
| 2.3.1 PCR扩增、克隆与测序 | 第40-41页 |
| 2.3.2 QPCR检测卵泡不同发育时期相关基因的表达规律 | 第41-42页 |
| 2.3.3 水牛BMP15启动子的构建和启动活性的分析 | 第42-43页 |
| 2.3.4 水牛BMP15和GDF9发生相关基因生物信息学分析 | 第43-44页 |
| 2.4 结果分析及讨论 | 第44-45页 |
| 2.5 结论 | 第45-46页 |
| 第三章 CRISPR/Cas9系统敲除效率的研究 | 第46-56页 |
| 3.1 材料与方法 | 第46-47页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第46-47页 |
| 3.2 实验方法 | 第47-50页 |
| 3.2.1 gRNA设计 | 第47-48页 |
| 3.2.2 gRNA表达载体及活性验证载体的构建和检测 | 第48-49页 |
| 3.2.3 感受态制备及转化 | 第49页 |
| 3.2.4 gRNA活性分析 | 第49-50页 |
| 3.2.5 统计分析gRNA各位位点碱基分布的概率 | 第50页 |
| 3.3 实验结果 | 第50-54页 |
| 3.3.1 gRNA活性分析 | 第50页 |
| 3.3.2 不同gRNA和Cas9摩尔及培养时间对Cas9编辑效率的影响 | 第50-54页 |
| 3.3.3 活性gRNA各位点不同碱基分布概率统计 | 第54页 |
| 3.4 结果分析及讨论 | 第54-55页 |
| 3.5 结论 | 第55-56页 |
| 第四章 CRISPR/Cas9系统编辑人源miRNA的研究 | 第56-62页 |
| 4.1 材料与方法 | 第56-57页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第56-57页 |
| 4.2 实验方法 | 第57-58页 |
| 4.2.1 gRNA设计 | 第57-58页 |
| 4.2.2 gRNA表达载体及活性验证载体的构建和检测 | 第58页 |
| 4.2.3 gRNA活性分析 | 第58页 |
| 4.2.4 CRISPR/Cas9靶向编辑miRNA-182和miRNA-155的检测 | 第58页 |
| 4.2.5 miRNA-182和miRNA-155的靶向编辑效率的统计 | 第58页 |
| 4.3 实验结果 | 第58-61页 |
| 4.3.1 gRNA活性分析 | 第58-59页 |
| 4.3.2 CRISPR/Cas9靶向编辑miRNA-182和miRNA-155 | 第59-60页 |
| 4.3.3 miRNA-182和miRNA-155突变类型及效率的统计 | 第60-61页 |
| 4.4 结果分析及讨论 | 第61页 |
| 4.5 结论 | 第61-62页 |
| 第五章 应用CRISPR/Cas9系统编辑水牛体细胞基因组的研究 | 第62-76页 |
| 5.1 材料与方法 | 第62-63页 |
| 5.1.1 实验材料 | 第63页 |
| 5.2 实验方法 | 第63-68页 |
| 5.2.1 引物设计 | 第63-64页 |
| 5.2.2 gRNA表达载体及活性验证载体的构建和检测 | 第64-65页 |
| 5.2.3 感受态制备及转化 | 第65页 |
| 5.2.4 gRNA活性分析 | 第65页 |
| 5.2.5 BFF细胞的分离和培养 | 第65-66页 |
| 5.2.6 BFF细胞冻存与复苏 | 第66页 |
| 5.2.7 BFF细胞的转染 | 第66页 |
| 5.2.8 CRISPR/Cas9靶向编辑水牛BMP15和GDF9的检测 | 第66-67页 |
| 5.2.9 CRISPR/Cas9靶向编辑水牛BMP15基因脱靶效率的检测 | 第67页 |
| 5.2.10 CRISPR/Cas9靶向编辑水牛BMP15基因大片段删除的检测 | 第67页 |
| 5.2.11 CRISPR/Cas9靶向同时编辑BMP15和GDF9基因的检测 | 第67-68页 |
| 5.3 实验结果 | 第68-74页 |
| 5.3.1 水牛BMP15和GDF9的gRNA活性分析 | 第68-69页 |
| 5.3.2 水牛gRNA4-bBMP15和gRNA5-GDF9靶向敲除的检测 | 第69-71页 |
| 5.3.3 水牛gRNA5-bBMP15和gRNA4-GDF9靶向敲除的检测 | 第71-72页 |
| 5.3.4 水牛BMP15基因大片段的删除 | 第72-73页 |
| 5.3.5 CRISPR/Cas9在水牛BFF细胞脱靶效率的分析 | 第73-74页 |
| 5.4 结果分析及讨论 | 第74-75页 |
| 5.5 结论 | 第75-76页 |
| 第六章 基因断裂DNA修复机制的选择的探究 | 第76-85页 |
| 6.1 材料与方法 | 第76-77页 |
| 6.1.1 实验材料 | 第76-77页 |
| 6.2 试验方法 | 第77-78页 |
| 6.2.1 gRNA设计 | 第77页 |
| 6.2.2 293T细胞对不同药物的毒性分析 | 第77页 |
| 6.2.3 细胞转染Reportor及相应gRNA表达载体 | 第77-78页 |
| 6.2.4 转染后细胞总RNA及蛋白的提取 | 第78页 |
| 6.2.5 细胞周期的分析 | 第78页 |
| 6.3 实验结果 | 第78-83页 |
| 6.3.1 293T细胞对不同药物的毒性分析 | 第78-79页 |
| 6.3.2 Reportor荧光表达流式分析 | 第79页 |
| 6.3.3 不同药物联合处理处理对DNA修复机制的选择分析 | 第79-81页 |
| 6.3.4 TSA处理后对细胞周期的影响 | 第81-83页 |
| 6.4 结果分析及讨论 | 第83-84页 |
| 6.5 结论 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-96页 |
| 致谢 | 第96-97页 |
| 攻读硕博期间发表学术论文 | 第97页 |
