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人乳铁蛋白基因定点敲入β乳球蛋白位点基因打靶奶山羊的研制

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人乳铁蛋白基因定点敲入β乳球蛋白位点基因打靶奶山羊的研制
论文目录
 
摘要第1-7页
ABSTRACT第7-14页
文献综述第14-36页
第一章 转基因技术在家畜中应用的研究进展第14-19页
  1.1 应用于家畜生产的转基因技术概况第14-17页
    1.1.1 慢病毒介导的转基因技术第14页
    1.1.2 条件型转基因技术第14-15页
    1.1.3 RNAi介导的转基因技术第15页
    1.1.4 转座子转基因技术第15-16页
    1.1.5 人工核酸酶技术第16-17页
  1.2 转基因技术在家畜繁殖育种方面的应用第17-19页
    1.2.1 在提高家畜乳制品质量方面的应用第17页
    1.2.2 在家畜生长和胴体成分组成改善方面的应用第17-18页
    1.2.3 在家畜抗病方面的应用第18页
    1.2.4 在家畜繁殖性能和生产力提高方面的应用第18页
    1.2.5 在生产环境友好型家畜方面的应用第18-19页
第二章 基因打靶技术研究进展第19-36页
  2.1 基因打靶技术的发展第19-20页
  2.2 人工核酸酶技术第20-30页
    2.2.1 锌指核酸酶第20-23页
    2.2.2 类转录激活因子效应物核酸酶第23-26页
    2.2.3 CRISPR/Cas9第26-28页
    2.2.4 人工核酸酶的优化策略第28-29页
    2.2.5 ZFN、TALEN与RGEN的优缺点比较第29-30页
  2.3 基因打靶技术的基本策略第30-32页
    2.3.1 基因敲除第31页
    2.3.2 基因敲入第31-32页
    2.3.3 基因修正和点突变第32页
    2.3.4 染色体重排第32页
  2.4 基因打靶技术的应用第32-35页
    2.4.1 在胚胎干细胞中的应用第32-33页
    2.4.2 在生产疾病模型中的应用第33页
    2.4.3 在抗病育种转基因动物生产方面的应用第33页
    2.4.4 在研究基因功能和细胞治疗方面的应用第33-34页
    2.4.5 在制备生物反应器方面的应用第34页
    2.4.6 在人类健康方面的应用第34-35页
  2.5 选题背景与目的意义第35-36页
试验研究第36-100页
第三章 靶向山羊BLG基因的ZFNS、TALENS及基因打靶载体的制备与功能分析第36-61页
  3.1 材料与试剂第37-38页
    3.1.1 材料第37页
    3.1.2 质粒第37页
    3.1.3 试剂第37-38页
    3.1.4 引物合成及测序第38页
  3.2 方法第38-47页
    3.2.1 奶山羊BLG位点的ZFNs表达质粒的制备与鉴定第38页
    3.2.2 奶山羊BLG位点的TALENs表达质粒的制备与鉴定第38-39页
    3.2.3 奶山羊BLG位点G418抗性基因打靶载体pG的构建第39-43页
    3.2.4 奶山羊BLG位点puro抗性基因打靶载体pHSQ的构建第43-44页
    3.2.5 奶山羊BLG位点基因打靶载体各元件的生物活性鉴定第44页
    3.2.6 ZFN与TALEN介导基因打靶载体在山羊BLG位点的同源重组活性鉴定第44-45页
    3.2.7 奶山羊BLG位点基因打靶载体在奶山羊乳腺上皮细胞中的功能鉴定第45-47页
  3.3 结果第47-58页
    3.3.1 奶山羊BLG位点的ZFNs表达质粒的制备及酶切鉴定第47-48页
    3.3.2 奶山羊BLG位点的TALENs表达质粒的制备及酶切鉴定第48-49页
    3.3.3 酵母MEL1报告分析ZFNs表达质粒的切割活性第49-50页
    3.3.4 奶山羊BLG位点基因打靶载体pG的构建与鉴定第50-53页
    3.3.5 奶山羊BLG位点基因打靶载体pHSQ的构建与鉴定第53-55页
    3.3.6 ZFN与TALEN介导基因打靶载体在山羊BLG位点的同源重组活性鉴定第55-56页
    3.3.7 基因打靶载体在奶山羊乳腺上皮细胞的功能鉴定第56-58页
  3.4 讨论第58-60页
  3.5 小结第60-61页
第四章 ZFN与TALEN介导HLF定向整合至奶山羊BLG位点的效率评估第61-78页
  4.1 材料与试剂第62页
    4.1.1 材料第62页
    4.1.2 试剂第62页
    4.1.3 引物合成及测序第62页
  4.2 方法第62-67页
    4.2.1 原代奶山羊胎儿成纤维细胞的培养与性别鉴定第62-63页
    4.2.2 TALEN与ZFN介导hLF定向整合至BLG位点阳性细胞的筛选第63-64页
    4.2.3 TALEN与ZFN介导hLF定向整合至BLG位点阳性细胞的鉴定第64-67页
  4.3 结果第67-75页
    4.3.1 奶山羊胎儿成纤维细胞的培养结果第67-68页
    4.3.2 ZFN介导hLF整合至BLG位点的阳性克隆筛选与鉴定第68-71页
    4.3.3 TALEN介导hLF整合至BLG位点的阳性克隆筛选与鉴定第71-74页
    4.3.4 ZFN与TALEN介导hLF整合至BLG位点的效率评估第74-75页
  4.4 讨论第75-76页
  4.5 小结第76-78页
第五章 应用体细胞核移植技术生产基因打靶奶山羊第78-89页
  5.1 材料与试剂第78-79页
    5.1.1 材料第78-79页
    5.1.2 试剂第79页
    5.1.3 测试化验加工第79页
  5.2 方法第79-82页
    5.2.1 体细胞核移植、胚胎移植第79-80页
    5.2.2 基因打靶克隆奶山羊的鉴定第80-82页
  5.3 结果第82-86页
    5.3.1 基因打靶细胞的体细胞核移植与克隆胚胎的发育第82-84页
    5.3.2 基因打靶克隆奶山羊的PCR和测序鉴定第84-86页
    5.3.3 基因打靶克隆奶山羊的southern blot鉴定第86页
  5.4 讨论第86-88页
  5.5 小结第88-89页
第六章 基因打靶克隆奶山羊的检测第89-100页
  6.1 试剂第90页
  6.2 方法第90-94页
    6.2.1 基因打靶克隆奶山羊的发情鉴定及配种第90页
    6.2.2 基因打靶克隆奶山羊的后代生产与鉴定第90页
    6.2.3 基因打靶克隆奶山羊的乳汁组分鉴定第90-91页
    6.2.4 基因打靶克隆奶山羊乳汁中BLG表达检测第91-93页
    6.2.5 基因打靶克隆奶山羊乳汁中外源基因hLF的表达检测第93-94页
  6.3 结果第94-98页
    6.3.1 基因打靶克隆奶山羊繁殖性能评估结果第94页
    6.3.2 基因打靶克隆奶山羊的后代生产与鉴定结果第94-95页
    6.3.3 基因打靶奶山羊的乳汁成分分析结果第95-96页
    6.3.4 基因打靶克隆奶山羊乳汁中BLG表达检测第96-97页
    6.3.5 基因打靶奶山羊乳汁的hLF表达检测第97-98页
  6.4 讨论第98-99页
  6.5 小结第99-100页
结论第100-101页
创新之处和进一步研究的课题第101-102页
参考文献第102-121页
附录第121-125页
致谢第125-126页
作者简介第126页

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