论文目录 | |
| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-12页 |
| 1 引言 | 第12-25页 |
| 1.1 围食膜简介 | 第12-16页 |
| 1.1.1 围食膜的形成 | 第12-13页 |
| 1.1.2 围食膜蛋白分类及各组分的作用 | 第13-15页 |
| 1.1.3 围食膜的生理功能 | 第15-16页 |
| 1.2 围食膜因子（PERITROPHINS）的研究进展 | 第16-18页 |
| 1.3 蛋白酶 | 第18-20页 |
| 1.3.1 氨肽酶（APN）和碱性磷酸酶（ALP） | 第18-19页 |
| 1.3.2 消化酶 | 第19页 |
| 1.3.3 解毒酶 | 第19-20页 |
| 1.4 CDA 类蛋白 | 第20-22页 |
| 1.5 实时定量 PCR（REAL-TIME PCR） | 第22-23页 |
| 1.5.1 Real‐time PCR原理 | 第22页 |
| 1.5.2 Real‐time PCR 的种类 | 第22-23页 |
| 1.5.3 Real‐time PCR和常规 PCR 的区别 | 第23页 |
| 1.5.4 Real‐time PCR数据分析 | 第23页 |
| 1.5.5 Real‐time PCR定量方法 | 第23页 |
| 1.6 选题依据及目的意义 | 第23-25页 |
| 2 暗黑鳃金龟幼虫中肠 CDNA 表达文库的构建及免疫筛选 | 第25-36页 |
| 2.1 材料 | 第25-26页 |
| 2.1.1 供试昆虫 | 第25页 |
| 2.1.2 供试菌株、限制酶及试剂盒 | 第25页 |
| 2.1.3 培养基 | 第25-26页 |
| 2.1.4 试剂及溶液 | 第26页 |
| 2.1.5 主要仪器设备 | 第26页 |
| 2.2 方法 | 第26-32页 |
| 2.2.1 中肠组织的收集 | 第26页 |
| 2.2.2 总 RNA 的提取与 mRNA 纯化 | 第26-27页 |
| 2.2.3 cDNA的合成及分级、纯化、定量 | 第27-29页 |
| 2.2.4 cDNA 的体外包装、文库扩增与滴度测定 | 第29-30页 |
| 2.2.5 cDNA文库插入片段大小鉴定 | 第30-31页 |
| 2.2.6 cDNA表达文库的免疫筛选 | 第31页 |
| 2.2.7 阳性克隆的鉴定及序列分析 | 第31-32页 |
| 2.2.8 cDNA的序列分析 | 第32页 |
| 2.3 结果与分析 | 第32-34页 |
| 2.3.1 总 RNA 的提取 | 第32页 |
| 2.3.2 mRNA的分离纯化 | 第32-33页 |
| 2.3.3 cDNA第一链和第二链的合成 | 第33页 |
| 2.3.4 cDNA定量 | 第33页 |
| 2.3.5 cDNA文库的滴度及重组率检测 | 第33页 |
| 2.3.6 cDNA文库插入片断大小的 PCR 鉴定 | 第33-34页 |
| 2.3.7 阳性克隆的筛选与鉴定 | 第34页 |
| 2.3.8 阳性克隆基因的序列分析 | 第34页 |
| 2.4 讨论 | 第34-35页 |
| 2.5 小结 | 第35-36页 |
| 3 暗黑鳃金龟几丁质结合蛋白基因的克隆、表达及功能分析 | 第36-54页 |
| 3.1 实验材料 | 第36-37页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第36页 |
| 3.1.2 试剂和溶液 | 第36页 |
| 3.1.3 培养基 | 第36-37页 |
| 3.1.4 主要仪器设备 | 第37页 |
| 3.2 方法 | 第37-44页 |
| 3.2.1 hpcbp45基因原核表达 | 第37-39页 |
| 3.2.2 生物信息学分析 | 第39页 |
| 3.2.3 hpcbp45基因的真核表达 | 第39-42页 |
| 3.2.4 HpCBP45蛋白的几丁质结合活性 | 第42-43页 |
| 3.2.5 hpcbp45基因转录水平组织定位分析 | 第43-44页 |
| 3.3 结果与分析 | 第44-52页 |
| 3.3.1 hpcbp45的生物信息学分析 | 第44-47页 |
| 3.3.2 系统进化树的构建 | 第47页 |
| 3.3.3 hpcbp45基因原核重组表达载体的鉴定 | 第47-48页 |
| 3.3.4 hpcbp45基因的原核表达 | 第48页 |
| 3.3.5 重组酵母 GS115（pPIC9K‐hpcbp45）的构建 | 第48-50页 |
| 3.3.6 hpcbp45基因在毕赤酵母中的表达 | 第50页 |
| 3.3.7 HpCBP45重组蛋白的几丁质活性 | 第50-51页 |
| 3.3.8 hpcbp45基因组织表达分析 | 第51-52页 |
| 3.4 讨论 | 第52页 |
| 3.5 小结 | 第52-54页 |
| 4 暗黑鳃金龟羧酸酯酶基因的克隆、表达及活性分析 | 第54-63页 |
| 4.1 材料与方法 | 第54-56页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第54页 |
| 4.1.2 hpce19 基因的原核表达 | 第54-55页 |
| 4.1.3 hpce19 基因的真核表达 | 第55-56页 |
| 4.1.4 重组羧酸酯酶 HpCE19 活性测定 | 第56页 |
| 4.1.5 暗黑鳃金龟羧酸酯酶基因 hpce19 的组织表达分析 | 第56页 |
| 4.2 结果与分析 | 第56-61页 |
| 4.2.1 羧酸酯酶 hpce19 生物信息学分析 | 第56-58页 |
| 4.2.2 已知昆虫羧酸酯酶间同源性进化树 | 第58页 |
| 4.2.3 羧酸酯酶基因 hpce19 的原核表达 | 第58-59页 |
| 4.2.4 酵母重组表达载体的鉴定 | 第59-60页 |
| 4.2.5 重组酵母的诱导表达 | 第60页 |
| 4.2.6 重组羧酸酯酶活性测定 | 第60页 |
| 4.2.7 暗黑鳃金龟羧酸酯酶基因组织表达分析 | 第60-61页 |
| 4.3 讨论 | 第61页 |
| 4.4 小结 | 第61-63页 |
| 5 暗黑鳃金龟幼虫几丁质脱乙酰酶基因的克隆、表达及功能分析 | 第63-76页 |
| 5.1 实验材料 | 第63-64页 |
| 5.1.1 供试昆虫与昆虫细胞系 | 第63页 |
| 5.1.2 菌株和质粒 | 第63页 |
| 5.1.3 培养基与筛选试剂 | 第63-64页 |
| 5.2 方法 | 第64-68页 |
| 5.2.1 hpcda5基因原核表达 | 第64页 |
| 5.2.2 hpcda5基因在昆虫细胞中的表达 | 第64-67页 |
| 5.2.3 几丁质活性检测 | 第67页 |
| 5.2.4 hpcda5基因转录水平组织定位分析 | 第67页 |
| 5.2.5 饲喂 Cry8Ea3 蛋白对 hpcda5 基因的表达调控 | 第67-68页 |
| 5.3 结果与分析 | 第68-74页 |
| 5.3.1 几丁质脱乙酰酶 HpCDA5 序列分析 | 第68-69页 |
| 5.3.2 系统进化树的构建 | 第69页 |
| 5.3.3 hpcda5原核重组表达载体的构建 | 第69-70页 |
| 5.3.4 重组质粒 pET30a‐hpcda5 在原核细胞中的表达 | 第70页 |
| 5.3.5 重组杆状病毒转座载体的鉴定 | 第70-71页 |
| 5.3.6 hpcda5基因在昆虫细胞中的表达 | 第71-72页 |
| 5.3.7 活性测定 | 第72-73页 |
| 5.3.8 hpcda5基因组织表达分析 | 第73页 |
| 5.3.9 Cry蛋白对 hpcda5 基因表达的调控 | 第73-74页 |
| 5.4 讨论 | 第74-75页 |
| 5.5 小结 | 第75-76页 |
| 全文结论 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-87页 |
| 附录1 缩略词 | 第87-89页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第89-90页 |
| 作者简历 | 第90-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
